Terima kasih telah mengunjungi Nature.com.Versi browser yang Anda gunakan memiliki dukungan CSS yang terbatas.Untuk pengalaman terbaik, kami menyarankan Anda menggunakan browser yang diperbarui (atau menonaktifkan Mode Kompatibilitas di Internet Explorer).Sementara itu, untuk memastikan dukungan berkelanjutan, kami akan merender situs tanpa gaya dan JavaScript.
Toxoplasma gondii adalah parasit protozoa intraseluler yang memodulasi lingkungan mikro dari inang yang terinfeksi dan diketahui berhubungan dengan kejadian pertumbuhan tumor otak.Dalam penelitian ini, kami berhipotesis bahwa miRNA-21 eksosom dari infeksi Toksoplasma mendorong pertumbuhan tumor otak.Eksosom dari mikroglia BV2 yang terinfeksi Toxoplasma dikarakterisasi dan internalisasi sel glioma U87 dikonfirmasi.Profil ekspresi mikroRNA eksosom dianalisis menggunakan susunan mikroRNA dan mikroRNA-21A-5p yang terkait dengan Toxoplasma gondii dan penyortiran tumor.Kami juga menyelidiki tingkat mRNA gen terkait tumor dalam sel glioma U87 dengan mengubah tingkat miR-21 dalam eksosom dan efek eksosom pada proliferasi sel glioma U87 manusia.Pada eksosom sel glioma U87 yang terinfeksi Toxoplasma gondii, ekspresi microRNA-21 meningkat dan aktivitas gen antitumor (FoxO1, PTEN, dan PDCD4) berkurang.Eksosom turunan BV2 yang terinfeksi Toxoplasma menginduksi proliferasi sel glioma U87.Eksosom menginduksi pertumbuhan sel U87 dalam model tumor tikus.Kami menyarankan bahwa peningkatan miR-21 eksosom pada mikroglia BV2 yang terinfeksi Toksoplasma mungkin memainkan peran penting sebagai pemacu pertumbuhan sel dalam sel glioma U87 dengan menurunkan regulasi gen antitumor.
Diperkirakan lebih dari 18,1 juta kasus kanker stadium lanjut didiagnosis di seluruh dunia pada tahun 2018, dengan sekitar 297.000 tumor sistem saraf pusat didiagnosis setiap tahun (1,6% dari seluruh tumor)1.Penelitian sebelumnya menunjukkan bahwa faktor risiko berkembangnya tumor otak manusia mencakup berbagai produk kimia, riwayat keluarga, dan radiasi pengion dari peralatan terapi dan diagnostik kepala.Namun, penyebab pasti dari penyakit ganas ini belum diketahui.Sekitar 20% dari seluruh kanker di seluruh dunia disebabkan oleh agen infeksi, termasuk virus, bakteri, dan parasit3,4.Patogen menular mengganggu mekanisme genetik sel inang, seperti perbaikan DNA dan siklus sel, serta dapat menyebabkan peradangan kronis dan kerusakan pada sistem kekebalan5.
Agen infeksi yang terkait dengan kanker manusia adalah patogen virus yang paling umum, termasuk human papillomavirus dan virus hepatitis B dan C.Parasit juga dapat memainkan peran potensial dalam perkembangan kanker pada manusia.Beberapa spesies parasit, yaitu Schistosoma, Opishorchis viverrini, O. felineus, Clonorchis sinensis dan Hymenolepis nana, telah terlibat dalam berbagai jenis kanker pada manusia 6,7,8.
Toxoplasma gondii adalah protozoa intraseluler yang mengatur lingkungan mikro sel inang yang terinfeksi.Parasit ini diperkirakan menginfeksi sekitar 30% populasi dunia, sehingga seluruh populasi berisiko9,10.Toxoplasma gondii dapat menginfeksi organ vital, termasuk sistem saraf pusat (SSP), dan menyebabkan penyakit serius seperti meningitis dan ensefalitis yang fatal, terutama pada pasien dengan sistem kekebalan yang lemah9.Namun, Toxoplasma gondii juga dapat mengubah lingkungan pejamu yang terinfeksi dengan memodulasi pertumbuhan sel dan respons imun pada individu yang imunokompeten, yang mengarah pada pemeliharaan infeksi kronis tanpa gejala9,11.Menariknya, mengingat korelasi antara prevalensi T. gondii dan kejadian tumor otak, beberapa laporan menunjukkan bahwa perubahan lingkungan inang akibat infeksi T. gondii kronis menyerupai lingkungan mikro tumor.
Eksosom dikenal sebagai komunikator antar sel yang mengirimkan konten biologis, termasuk protein dan asam nukleat, dari sel tetangga16,17.Eksosom dapat mempengaruhi proses biologis terkait tumor seperti anti-apoptosis, angiogenesis, dan metastasis di lingkungan mikro tumor.Secara khusus, miRNA (miRNA), RNA non-coding kecil dengan panjang sekitar 22 nukleotida, merupakan regulator gen pasca-transkripsi penting yang mengontrol lebih dari 30% mRNA manusia melalui kompleks pembungkaman yang diinduksi miRNA (miRISC).Toxoplasma gondii dapat mengganggu proses biologis dengan mengendalikan ekspresi miRNA pada inang yang terinfeksi.MiRNA inang mengandung sinyal penting untuk mengatur proses biologis inang guna mencapai strategi kelangsungan hidup parasit.Dengan demikian, mempelajari perubahan profil miRNA inang setelah infeksi T. gondii dapat membantu kita memahami interaksi antara inang dan T. gondii dengan lebih jelas.Memang, Thirugnanam dkk.15 menyarankan bahwa T. gondii mendorong karsinogenesis otak dengan mengubah ekspresinya pada miRNA inang spesifik yang terkait dengan pertumbuhan tumor dan menemukan bahwa T. gondii dapat menyebabkan glioma pada hewan percobaan.
Penelitian ini berfokus pada perubahan miR-21 eksosom pada mikroglia inang yang terinfeksi Toxoplasma BV2.Kami mengamati kemungkinan peran perubahan miR-21 eksosom dalam pertumbuhan sel glioma U87 karena retensi dalam inti FoxO1/p27, yang merupakan target miR-21 yang diekspresikan secara berlebihan.
Eksosom yang berasal dari BV2 diperoleh dengan menggunakan sentrifugasi diferensial dan divalidasi dengan berbagai metode untuk mencegah kontaminasi dengan komponen seluler atau vesikel lain.Elektroforesis gel SDS-poliakrilamida (SDS-PAGE) menunjukkan pola berbeda antara protein yang diekstraksi dari sel BV2 dan eksosom (Gambar 1A), dan sampel dinilai untuk keberadaan Alix, yang dianalisis dengan Western blotting penanda protein eksosom di .Pelabelan Alix ditemukan pada protein eksosom tetapi tidak pada protein lisat sel BV2 (Gbr. 1B).Selain itu, RNA murni dari eksosom yang berasal dari BV2 dianalisis menggunakan bioanalyzer.Subunit ribosom 18S dan 28S jarang diamati dalam pola migrasi RNA eksosom, yang menunjukkan kemurnian yang dapat diandalkan (Gambar 1C).Akhirnya, mikroskop elektron transmisi menunjukkan bahwa eksosom yang diamati berukuran sekitar 60-150 nm dan memiliki struktur seperti cangkir yang khas dari morfologi eksosom (Gambar 1D).
Karakterisasi eksosom yang berasal dari sel BV2.(A) Halaman lembar data keselamatan.Protein diisolasi dari sel BV2 atau eksosom yang berasal dari BV2.Pola protein berbeda antara sel dan eksosom.(B) Analisis Western blot dari penanda eksosom (Alix).(C) Evaluasi RNA yang dimurnikan dari sel BV2 dan eksosom turunan BV2 menggunakan bioanalyzer.Dengan demikian, subunit ribosom 18S dan 28S dalam sel BV2 jarang ditemukan pada RNA eksosom.(D) Mikroskop elektron transmisi menunjukkan bahwa eksosom yang diisolasi dari sel BV2 diwarnai secara negatif dengan 2% uranil asetat.Eksosom berukuran sekitar 60-150 nm dan berbentuk cangkir (Song dan Jung, data tidak dipublikasikan).
Internalisasi seluler eksosom turunan BV2 ke dalam sel glioma manusia U87 diamati menggunakan mikroskop confocal.Eksosom berlabel PKH26 terlokalisasi di sitoplasma sel U87.Nuklei diwarnai dengan DAPI (Gambar 2A), menunjukkan bahwa eksosom yang diturunkan dari BV2 dapat diinternalisasi oleh sel inang dan mempengaruhi lingkungan sel penerima.
Internalisasi eksosom turunan BV2 ke dalam sel glioma U87 dan eksosom turunan BV2 yang terinfeksi Toxoplasma RH menginduksi proliferasi sel glioma U87.(A) Eksosom yang ditelan oleh sel U87 diukur dengan mikroskop confocal.Sel glioma U87 diinkubasi dengan eksosom berlabel PKH26 (merah) atau tanpa kontrol selama 24 jam.Inti diwarnai dengan DAPI (biru) dan kemudian diamati di bawah mikroskop confocal (skala bar: 10 μm, x 3000).(B) Proliferasi sel glioma U87 ditentukan dengan uji proliferasi sel.Sel glioma U87 diobati dengan eksosom untuk waktu yang ditentukan. *P <0,05 diperoleh dengan uji t Student. *P <0,05 diperoleh dengan uji t Student. *P < 0,05 получено по t-критерию Стьюдента. *P <0,05 berdasarkan uji-t Student. *P < 0,05 通过学生t 检验获得。 *P <0,05 * P < 0,05, полученный с помощью t-критерия Стьюдента. * P < 0,05 diperoleh dengan menggunakan uji-t Student.
Setelah mengkonfirmasi internalisasi eksosom turunan BV2 ke dalam sel glioma U87, kami melakukan uji proliferasi sel untuk menyelidiki peran eksosom turunan Toksoplasma turunan BV2 dalam pengembangan sel glioma manusia.Pengobatan sel U87 dengan eksosom dari sel BV2 yang terinfeksi T. gondii menunjukkan bahwa eksosom turunan BV2 yang terinfeksi T. gondii menyebabkan proliferasi sel U87 yang jauh lebih tinggi dibandingkan dengan kontrol (Gambar 2B).
Selain itu, pertumbuhan sel U118 memiliki hasil yang sama dengan U87, karena Toksoplasma merangsang eksosom yang menyebabkan tingkat proliferasi tertinggi (data tidak ditunjukkan).Berdasarkan data ini, kami dapat menunjukkan bahwa eksosom yang terinfeksi Toxoplasma yang diturunkan dari BV2 memainkan peran penting dalam proliferasi sel glioma.
Untuk menyelidiki efek eksosom turunan BV2 yang terinfeksi Toxoplasma pada perkembangan tumor, kami menyuntikkan sel glioma U87 ke tikus telanjang untuk model xenograft dan menyuntikkan eksosom turunan BV2 atau eksosom turunan BV2 yang terinfeksi RH.Setelah tumor terlihat setelah 1 minggu, setiap kelompok percobaan yang terdiri dari 5 tikus dibagi menurut ukuran tumor untuk menentukan titik awal yang sama, dan ukuran tumor diukur selama 22 hari.
Pada tikus dengan model xenograft U87, ukuran dan berat tumor yang secara signifikan lebih besar diamati pada kelompok eksosom yang terinfeksi RH yang diturunkan dari BV2 pada hari ke 22 (Gambar 3A,B).Di sisi lain, tidak ada perbedaan yang signifikan dalam ukuran tumor antara kelompok eksosom yang diturunkan BV2 dan kelompok kontrol setelah pengobatan eksosom.Selain itu, tikus yang disuntik dengan sel glioma dan eksosom secara visual menunjukkan volume tumor terbesar pada kelompok eksosom turunan BV2 yang terinfeksi RH (Gambar 3C).Hasil ini menunjukkan bahwa eksosom yang terinfeksi Toksoplasma yang diturunkan dari BV2 menginduksi pertumbuhan glioma pada model tumor tikus.
Onkogenesis (AC) dari eksosom turunan BV2 dalam model tikus xenograft U87.Ukuran tumor (A) dan berat (B) meningkat secara signifikan pada tikus telanjang BALB/c yang diobati dengan eksosom yang terinfeksi RH yang berasal dari BV2.Tikus telanjang BALB/c (C) disuntik secara subkutan dengan 1 x 107 sel U87 yang disuspensikan dalam campuran Matrigel.Enam hari setelah injeksi, 100 μg eksosom turunan BV2 diobati pada tikus.Ukuran dan berat tumor diukur masing-masing pada hari yang ditentukan dan setelah pengorbanan. *P <0,05. *P <0,05. *Р < 0,05. *P <0,05. *P <0,05。 *P <0,05。 *Р < 0,05. *P <0,05.
Data menunjukkan bahwa 37 miRNA (16 diekspresikan berlebih dan 21 diekspresikan menurun) terkait dengan imunitas atau perkembangan tumor secara signifikan diubah dalam mikroglia setelah infeksi strain Toxoplasma RH (Gambar 4A).Tingkat ekspresi relatif miR-21 di antara miRNA yang diubah dikonfirmasi oleh RT-PCR waktu nyata dalam eksosom yang berasal dari BV2, eksosom yang diobati dengan sel BV2 dan U87.Ekspresi miR-21 menunjukkan peningkatan eksosom yang signifikan dari sel BV2 yang terinfeksi Toxoplasma gondii (strain RH) (Gambar 4B).Tingkat ekspresi relatif miR-21 dalam sel BV2 dan U87 meningkat setelah penggunaan eksosom yang diubah (Gambar 4B).Tingkat relatif ekspresi miR-21 di jaringan otak pasien tumor dan tikus yang terinfeksi Toxoplasma gondii (strain ME49) masing-masing lebih tinggi dibandingkan kontrol (Gambar 4C).Hasil ini berkorelasi dengan perbedaan antara tingkat ekspresi microRNA yang diprediksi dan dikonfirmasi secara in vitro dan in vivo.
Perubahan ekspresi miP-21a-5p eksosom pada mikroglia yang terinfeksi Toxoplasma gondii (RH).(A) Menunjukkan perubahan signifikan pada siRNA yang terkait dengan kekebalan atau perkembangan tumor setelah infeksi T. gondii RH.(B) Tingkat ekspresi relatif miR-21 terdeteksi oleh RT-PCR real-time pada eksosom yang diturunkan dari BV2, eksosom yang diobati dengan BV2, dan sel U87.(C) Tingkat ekspresi relatif miR-21 ditemukan di jaringan otak pasien tumor (N=3) dan tikus yang terinfeksi Toxoplasma gondii (strain ME49) (N=3). *P <0,05 diperoleh dengan uji t Student. *P <0,05 diperoleh dengan uji t Student. *P < 0,05 было получено с помощью t-критерия Стьюдента. *P <0,05 diperoleh dengan menggunakan uji-t Student. *P < 0,05 通过学生t 检验获得。 *P <0,05 * P <0,05, полученный с помощью t-критерия Стьюдента. * P < 0,05 diperoleh dengan menggunakan uji-t Student.
Eksosom dari sel BV2 yang terinfeksi RH menyebabkan pertumbuhan glioma in vivo dan in vitro (Gambar 2, 3).Untuk mendeteksi mRNA yang relevan, kami memeriksa level mRNA dari gen target antitumor, kotak forkhead O1 (FoxO1), PTEN, dan kematian sel terprogram 4 (PDCD4) dalam sel U87 yang terinfeksi eksosom yang berasal dari BV2 atau RH BV2.Analisis bioinformatika menunjukkan bahwa beberapa gen terkait tumor, termasuk gen FoxO1, PTEN, dan PDCD4, memiliki situs pengikatan miR-2121,22.Tingkat mRNA gen target antitumor berkurang pada eksosom turunan BV2 yang terinfeksi RH dibandingkan dengan eksosom turunan BV2 (Gambar 5A).FoxO1 menunjukkan penurunan kadar protein pada eksosom turunan BV2 yang terinfeksi RH dibandingkan dengan eksosom turunan BV2 (Gambar 5B).Berdasarkan hasil ini, kami dapat memastikan bahwa eksosom yang berasal dari BV2 yang terinfeksi RH menurunkan regulasi gen anti-onkogenik, sehingga mempertahankan perannya dalam pertumbuhan tumor.
Eksosom turunan BV2 yang terinfeksi Toxoplasma RH menginduksi penekanan gen antitumor dalam sel glioma U87 oleh eksosom turunan BV2 yang terinfeksi Toxoplasma RH.(A) PCR real-time dari ekspresi FoxO1, PTEN dan PDCD4 dalam eksosom yang berasal dari BV2 yang terinfeksi T. gondii RH dibandingkan dengan eksosom PBS.β-aktin mRNA digunakan sebagai kontrol.(B) Ekspresi FoxO1 ditentukan oleh Western blotting dan data densitometri dievaluasi secara statistik menggunakan program ImageJ. *P <0,05 diperoleh dengan uji t Student. *P <0,05 diperoleh dengan uji t Student. *P < 0,05 было получено с помощью t-критерия Стьюдента. *P <0,05 diperoleh dengan menggunakan uji-t Student. *P < 0,05 通过学生t 检验获得。 *P <0,05 * P <0,05, полученный с помощью t-критерия Стьюдента. * P < 0,05 diperoleh dengan menggunakan uji-t Student.
Untuk memahami efek miP-21 dalam eksosom terhadap regulasi gen terkait tumor, sel U87 ditransfeksi dengan inhibitor miP-21 menggunakan Lipofectamine 2000 dan sel dipanen 24 jam setelah transfeksi.Tingkat ekspresi FoxO1 dan p27 dalam sel yang ditransfeksi dengan inhibitor miR-21 dibandingkan dengan sel yang diobati dengan eksosom turunan BV2 menggunakan qRT-PCR (Gambar 6A,B).Transfeksi inhibitor miR-21 ke dalam sel U87 secara signifikan menurunkan regulasi ekspresi FoxO1 dan p27 (Gbr. 6).
MiP-21 eksosomal BV2 yang terinfeksi RH mengubah ekspresi FoxO1/p27 dalam sel glioma U87.Sel U87 ditransfeksi dengan inhibitor miP-21 menggunakan Lipofectamine 2000 dan sel dipanen 24 jam setelah transfeksi.Tingkat ekspresi FoxO1 dan p27 dalam sel yang ditransfeksi dengan inhibitor miR-21 dibandingkan dengan tingkat dalam sel yang diobati dengan eksosom turunan BV2 menggunakan qRT-PCR (A, B).
Untuk menghindari respon imun inang, parasit Toksoplasma berubah menjadi kista jaringan.Mereka menjadi parasit di berbagai jaringan, termasuk otak, jantung, dan otot rangka, sepanjang hidup inang dan memodulasi respon imun inang.Selain itu, mereka dapat mengatur siklus sel dan apoptosis sel inang, sehingga mendorong proliferasinya14,24.Toxoplasma gondii sebagian besar menginfeksi sel dendritik inang, neutrofil, dan garis keturunan monosit/makrofag, termasuk mikroglia otak.Toxoplasma gondii menginduksi diferensiasi makrofag dari fenotip M2, mempengaruhi penyembuhan luka setelah infeksi patogen, dan juga berhubungan dengan hipervaskularisasi dan fibrosis granulomatosa.Patogenesis perilaku infeksi Toksoplasma ini mungkin terkait dengan penanda yang terkait dengan perkembangan tumor.Lingkungan tidak bersahabat yang diatur oleh Toksoplasma mungkin menyerupai prakanker terkait.Oleh karena itu, dapat diasumsikan bahwa infeksi Toksoplasma berkontribusi terhadap perkembangan tumor otak.Faktanya, tingkat infeksi Toksoplasma yang tinggi telah dilaporkan pada serum pasien dengan berbagai tumor otak.Selain itu, Toxoplasma gondii mungkin merupakan efektor karsinogenik lain dan bertindak secara sinergis untuk membantu karsinogen menular lainnya mengembangkan tumor otak.Dalam hal ini, perlu dicatat bahwa P. falciparum dan virus Epstein-Barr secara sinergis berkontribusi terhadap pembentukan limfoma Burkitt.
Peran eksosom sebagai pengatur dalam bidang penelitian kanker telah diselidiki secara luas.Namun, peran eksosom antara parasit dan inang yang terinfeksi masih kurang dipahami.Sejauh ini, berbagai regulator, termasuk protein yang disekresikan, telah menjelaskan proses biologis dimana parasit protozoa melawan serangan inang dan melanggengkan infeksi.Baru-baru ini, terdapat konsep yang berkembang bahwa mikrovesikel yang berhubungan dengan protozoa dan mikroRNAnya berinteraksi dengan sel inang untuk menciptakan lingkungan yang menguntungkan bagi kelangsungan hidup mereka.Oleh karena itu, penelitian lebih lanjut diperlukan untuk menemukan hubungan antara perubahan miRNA eksosom dan proliferasi sel glioma.Perubahan MicroRNA (gen cluster miR-30c-1, miR-125b-2, miR-23b-27b-24-1 dan miR-17-92) berikatan dengan promotor STAT3 pada makrofag manusia yang terinfeksi toksoplasma, diatur dan menginduksi anti -apoptosis sebagai respons terhadap infeksi Toxoplasma gondii 29 .Infeksi toksoplasma meningkatkan ekspresi miR-17-5p dan miR-106b-5p, yang berhubungan dengan beberapa penyakit hiperproliferatif 30 .Data ini menunjukkan bahwa miRNA inang yang diatur oleh infeksi Toksoplasma adalah molekul penting untuk kelangsungan hidup parasit dan patogenesis dalam perilaku biologis inang.
Perubahan miRNA dapat mempengaruhi berbagai jenis perilaku selama inisiasi dan perkembangan sel ganas, termasuk glioma: sinyal pertumbuhan yang mencukupi kebutuhan sendiri, ketidakpekaan terhadap sinyal penghambat pertumbuhan, penghindaran apoptosis, potensi replikasi yang tidak terbatas, angiogenesis, invasi dan metastasis, dan peradangan.Pada glioma, perubahan miRNA telah diidentifikasi dalam beberapa studi profil ekspresi.
Dalam penelitian ini, kami mengkonfirmasi tingkat ekspresi miRNA-21 yang tinggi pada sel inang yang terinfeksi toksoplasma.miR-21 telah diidentifikasi sebagai salah satu microRNA yang paling sering diekspresikan secara berlebihan pada tumor padat, termasuk glioma, dan ekspresinya berkorelasi dengan tingkat glioma.Bukti yang terkumpul menunjukkan bahwa miR-21 adalah onkogen baru yang bertindak sebagai faktor anti-apoptosis dalam pertumbuhan glioma dan diekspresikan secara berlebihan dalam jaringan dan plasma keganasan otak manusia.Menariknya, inaktivasi miR-21 dalam sel dan jaringan glioma memicu penghambatan proliferasi sel akibat apoptosis yang bergantung pada caspase.Analisis bioinformatik dari target prediksi miR-21 mengungkapkan beberapa gen penekan tumor yang terkait dengan jalur apoptosis, termasuk kematian sel terprogram 4 (PDCD4), tropomyosin (TPM1), PTEN, dan forkhead box O1 (FoxO1), dengan situs pengikatan miR-2121..22.38.
FoxO1, sebagai salah satu faktor transkripsi (FoxO), terlibat dalam perkembangan berbagai jenis kanker manusia dan dapat mengatur ekspresi gen penekan tumor seperti p21, p27, Bim, dan FasL40.FoxO1 dapat mengikat dan mengaktifkan penghambat siklus sel seperti p27 untuk menekan pertumbuhan sel.Selain itu, FoxO1 adalah efektor utama pensinyalan PI3K/Akt dan mengatur banyak proses biologis seperti perkembangan siklus sel dan diferensiasi sel melalui aktivasi transkripsi p2742.
Sebagai kesimpulan, kami percaya bahwa miR-21 eksosom yang berasal dari mikroglia yang terinfeksi Toksoplasma mungkin memainkan peran penting sebagai pengatur pertumbuhan sel glioma (Gambar 7).Namun, penelitian lebih lanjut diperlukan untuk menemukan hubungan langsung antara miR-21 eksosom, perubahan infeksi Toksoplasma, dan pertumbuhan glioma.Hasil ini diharapkan dapat menjadi titik awal untuk mempelajari hubungan infeksi Toksoplasma dengan kejadian glioma.
Diagram skema mekanisme karsinogenesis glioma (otak) diusulkan dalam penelitian ini.Penulis menggambar di PowerPoint 2019 (Microsoft, Redmond, WA).
Semua protokol eksperimental dalam penelitian ini, termasuk penggunaan hewan, sesuai dengan Pedoman Etika Standar Komite Perawatan Hewan dan Pengguna Universitas Nasional Seoul dan telah disetujui oleh Dewan Peninjau Institusi Fakultas Kedokteran Universitas Nasional Seoul (nomor IRB SNU- 150715).-2).Semua prosedur eksperimental dilakukan sesuai dengan rekomendasi ARRIVE.
Mikroglia tikus BV2 dan sel glioma manusia U87 dikultur dalam Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM; Welgene, Seoul, Korea) dan Roswell Park Memorial Institute's Medium (RPMI; Welgene), masing-masing, masing-masing mengandung 10% serum janin sapi, 4 mM l- glutamin, penisilin 0,2 mM dan streptomisin 0,05 mM.Sel dikultur dalam inkubator dengan 5% CO2 pada suhu 37°C.Garis sel glioma lain, U118, digunakan untuk perbandingan dengan sel U87.
Untuk mengisolasi eksosom dari strain RH dan ME49 yang terinfeksi T. gondii, takizoit T. gondii (strain RH) diambil dari rongga perut tikus BALB/c berumur 6 minggu yang disuntikkan 3-4 hari sebelumnya.Takizoit dicuci tiga kali dengan PBS dan dimurnikan dengan sentrifugasi dalam 40% Percoll (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)43.Untuk mendapatkan takizoit strain ME49, mencit BALB/c disuntik secara intraperitoneal dengan 20 jaringan kista dan transformasi takizoit dalam kista dikumpulkan dengan mencuci rongga perut pada hari ke 6-8 setelah infeksi (PI).Tikus yang terinfeksi PBS.Takizoit ME49 ditanam dalam sel yang dilengkapi dengan 100 μg/ml penisilin (Gibco/BRL, Grand Island, NY, USA), 100 μg/ml streptomisin (Gibco/BRL), dan 5% serum janin sapi (Lonza, Walkersville, MD) .., AS) pada suhu 37 °C dan 5% karbon dioksida.Setelah dikultur dalam sel Vero, takizoit ME49 dilewatkan dua kali melalui jarum ukuran 25 dan kemudian melalui filter 5 µm untuk menghilangkan kotoran dan sel.Setelah dicuci, takizoit diresuspensi dalam PBS44.Kista jaringan Toxoplasma gondii strain ME49 dipertahankan dengan injeksi kista intraperitoneal yang diisolasi dari otak tikus C57BL/6 yang terinfeksi (Orient Bio Animal Center, Seongnam, Korea).Otak tikus yang terinfeksi ME49 diambil setelah 3 bulan PI dan dicincang di bawah mikroskop untuk mengisolasi kista.Tikus yang terinfeksi disimpan dalam kondisi bebas patogen khusus (SPF) di Fakultas Kedokteran Universitas Nasional Seoul.
Total RNA diekstraksi dari eksosom yang diturunkan dari BV2, sel dan jaringan BV2 menggunakan miRNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden, Jerman) sesuai dengan instruksi pabrik, termasuk waktu inkubasi untuk langkah elusi.Konsentrasi RNA ditentukan pada spektrofotometer NanoDrop 2000.Kualitas microarray RNA dinilai menggunakan bioanalyzer Agilent 2100 (Agilent Technologies, Amstelveen, Belanda).
DMEM dengan 10% FBS miskin eksosom dibuat dengan ultrasentrifugasi pada 100.000 g selama 16 jam pada suhu 4°C dan disaring melalui filter 0,22 µm (Nalgene, Rochester, NY, USA).Sel BV2, 5 × 105, dikultur dalam DMEM yang mengandung 10% FBS yang habis eksosom dan 1% antibiotik pada suhu 37°C dan 5% CO2.Setelah 24 jam inkubasi, takizoit dari strain RH atau ME49 (MOI = 10) ditambahkan ke dalam sel dan parasit yang tidak menyerang dihilangkan dalam waktu satu jam dan diisi ulang dengan DMEM.Eksosom dari sel BV2 diisolasi dengan sentrifugasi diferensial yang dimodifikasi, metode yang paling banyak digunakan.Suspensikan kembali pelet eksosom dalam 300 μl PBS untuk analisis RNA atau protein.Konsentrasi eksosom yang diisolasi ditentukan dengan menggunakan alat uji protein BCA (Pierce, Rockford, IL, USA) dan spektrofotometer NanoDrop 2000.
Endapan dari sel BV2 atau eksosom yang berasal dari BV2 dilisiskan dalam larutan ekstraksi protein PRO-PREP™ (iNtRon Biotechnology, Seongnam, Korea) dan protein dimasukkan ke dalam gel poliakrilamida SDS 10% bernoda biru cemerlang Coomassie.Selain itu, protein dipindahkan ke membran PVDF selama 2 jam.Western blots divalidasi menggunakan antibodi Alix (Cell Signaling Technology, Beverly, MA, USA) sebagai penanda eksosom.IgG anti-tikus kambing terkonjugasi HRP (H + L) (Bethyl Laboratories, Montgomery, TX, USA) dan LAS-1000 plus penganalisis gambar luminescent (Fuji Photographic Film, Tokyo, Jepang) digunakan sebagai antibodi sekunder..Mikroskop elektron transmisi dilakukan untuk mempelajari ukuran dan morfologi eksosom.Eksosom yang diisolasi dari sel BV2 (6,40 µg/µl) dibuat pada jaring berlapis karbon dan diwarnai secara negatif dengan uranil asetat 2% selama 1 menit.Sampel yang telah disiapkan diamati pada tegangan percepatan 80 kV menggunakan JEOL 1200-EX II (Tokyo, Jepang) yang dilengkapi dengan kamera CCD Erlangshen ES1000W (Gatan, Pleasanton, CA, USA).
Eksosom yang diturunkan dari BV2 diwarnai menggunakan PKH26 Red Fluorescent Linker Kit (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) selama 15 menit pada suhu kamar.Sel U87, 2×105, dengan eksosom berlabel PKH26 (merah) atau tanpa eksosom sebagai kontrol negatif, diinkubasi pada suhu 37°C selama 24 jam dalam inkubator CO2 5%.Inti sel U87 diwarnai dengan DAPI (biru), sel U87 difiksasi dalam paraformaldehyde 4% selama 15 menit pada suhu 4 ° C dan kemudian dianalisis dalam sistem mikroskop confocal Leica TCS SP8 STED CW (Leica Microsystems, Mannheim, Jerman).tampak.
cDNA disintesis dari siRNA menggunakan sintesis untai pertama Mir-X siRNA dan kit SYBR qRT-PCR (Takara Bio Inc., Shiga, Jepang).PCR kuantitatif waktu nyata dilakukan menggunakan sistem deteksi PCR waktu nyata iQ5 (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) menggunakan primer dan templat yang dicampur dengan SYBR Premix.DNA diamplifikasi selama 40 siklus denaturasi pada suhu 95°C selama 15 detik dan anil pada suhu 60°C selama 60 detik.Data dari setiap reaksi PCR dianalisis menggunakan modul analisis data perangkat lunak sistem optik iQ™5 (Bio-Rad).Perubahan relatif dalam ekspresi gen antara gen target yang dipilih dan β-aktin/siRNA (dan U6) dihitung menggunakan metode kurva standar.Urutan primer yang digunakan ditunjukkan pada Tabel 1.
3 x 104 sel glioma U87 diunggulkan dalam 96-well plate dan dicampur dengan eksosom yang terinfeksi Toksoplasma yang berasal dari BV2 (50 μg/mL) atau eksosom nonpulsa yang berasal dari BV2 (50 μg/mL) sebagai kontrol pada 12, 18 dan 36 jam .Tingkat proliferasi sel ditentukan dengan menggunakan Cell Counting Kit-8 (Dojindo, Kumamoto, Jepang) (Gambar Tambahan S1-S3) 46.
Tikus telanjang BALB/c betina berumur 5 minggu dibeli dari Orient Bio (Seongnam-si, Korea Selatan) dan disimpan satu per satu dalam kandang steril pada suhu kamar (22±2°C) dan kelembaban (45±15°C).%) pada suhu kamar (22±2°C) dan kelembapan (45±15%).Siklus terang 12 jam dan siklus gelap 12 jam dilakukan di bawah SPF (Pusat Hewan Fakultas Kedokteran Universitas Nasional Seoul).Tikus secara acak dibagi menjadi tiga kelompok yang masing-masing terdiri dari 5 tikus dan semua kelompok disuntik secara subkutan dengan 400 ml PBS yang mengandung 1 x 107 sel glioma U87 dan faktor pertumbuhan yang mengurangi BD Matrigel™ (BD Science, Miami, FL, USA).Enam hari setelah injeksi tumor, 200 mg eksosom yang berasal dari sel BV2 (dengan/tanpa infeksi Toksoplasma) disuntikkan ke lokasi tumor.Dua puluh dua hari setelah infeksi tumor, ukuran tumor tikus di setiap kelompok diukur dengan jangka sorong tiga kali seminggu, dan volume tumor dihitung dengan rumus: 0,5×(lebar)×2×panjang.
Analisis ekspresi MicroRNA menggunakan array miRNA miRCURYTM LNA, generasi ke-7, array mmu dan rno (EXIQON, Vedbaek, Denmark) mencakup 1.119 tikus yang berkarakter baik di antara 3.100 probe penangkapan miRNA manusia, tikus, dan tikus.Selama prosedur ini, 250 hingga 1000 ng total RNA dihilangkan dari 5′-fosfat melalui pengobatan dengan alkali fosfatase usus anak sapi diikuti dengan pelabelan dengan pewarna fluoresen hijau Hy3.Sampel berlabel kemudian dihibridisasi dengan memuat slide microarray menggunakan kit ruang hibridisasi (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) dan kit slide hibridisasi (Agilent Technologies).Hibridisasi dilakukan selama 16 jam pada suhu 56°C, kemudian microarray dicuci sesuai dengan rekomendasi pabrik.Slide microarray yang telah diproses kemudian dipindai menggunakan sistem pemindai microarray Agilent G2565CA (Agilent Technologies).Gambar yang dipindai diimpor menggunakan perangkat lunak Agilent Feature Extraction versi 10.7.3.1 (Agilent Technologies) dan intensitas fluoresensi setiap gambar diukur menggunakan file GAL yang sesuai dari protokol Exiqon yang dimodifikasi.Data microarray untuk penelitian ini disimpan dalam database GEO dengan nomor akses GPL32397.
Profil ekspresi miRNA eksosom dewasa dalam mikroglia strain RH atau ME49 yang terinfeksi Toksoplasma dianalisis menggunakan berbagai alat jaringan.miRNA yang terkait dengan perkembangan tumor diidentifikasi menggunakan miRWalk2.0 (//mirwalk.umm.uni-heidelberg.de) dan disaring dengan intensitas sinyal yang dinormalisasi (log2) lebih besar dari 8,0.Di antara miRNA, miRNA yang diekspresikan secara berbeda ditemukan lebih dari 1,5 kali lipat diubah dengan analisis filter miRNA yang diubah oleh strain RH atau ME49 yang terinfeksi T. gondii.
Sel diunggulkan dalam pelat enam sumur (3 x 105 sel/sumur) dalam opti-MEM (Gibco, Carlsbad, CA, USA) menggunakan Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA).Sel yang ditransfusikan dikultur selama 6 jam dan kemudian medianya diubah menjadi media lengkap yang segar.Sel dipanen 24 jam setelah transfeksi.
Analisis statistik terutama dilakukan dengan menggunakan uji-t Student dengan perangkat lunak Excel (Microsoft, Washington, DC, USA).Untuk analisis hewan percobaan, ANOVA dua arah dilakukan menggunakan perangkat lunak Prism 3.0 (GraphPad Software, La Jolla, CA, USA). Nilai P <0,05 dianggap signifikan secara statistik. Nilai P <0,05 dianggap signifikan secara statistik. Значения P <0,05 считались статистически значимыми. Nilai P <0,05 dianggap signifikan secara statistik. P 值< 0,05 被认为具有统计学意义。 P 值< 0,05 Значения P <0,05 считались статистически значимыми. Nilai P <0,05 dianggap signifikan secara statistik.
Semua protokol eksperimental yang digunakan dalam penelitian ini telah disetujui oleh Institutional Review Board dari Fakultas Kedokteran Universitas Nasional Seoul (nomor IRB SNU-150715-2).
The data used in this study are available upon reasonable request from the first author (BK Jung; mulddang@snu.ac.kr). And the microarray data for the current study is deposited in the GEO database under registration number GPL32397.
Furley, J.dkk.Perkiraan kejadian dan kematian akibat kanker global pada tahun 2018: Sumber dan metode GLOBOCAN.Penafsiran.J.Ruck 144, 1941–1953 (2019).
Rasheed, S., Rehman, K. & Akash, MS Wawasan tentang faktor risiko tumor otak dan intervensi terapeutiknya. Rasheed, S., Rehman, K. & Akash, MS Wawasan tentang faktor risiko tumor otak dan intervensi terapeutiknya.Rashid, S., Rehman, K. dan Akash, MS Tinjauan faktor risiko tumor otak dan intervensi terapeutik utama. Rasheed, S., Rehman, K. & Akash, MS 深入了解脑肿瘤的危险因素及其治疗干预措施. Rasheed, S., Rehman, K. & Akash, MS Pemahaman mendalam tentang faktor risiko tumor otak dan intervensi terapeutik.Rashid, S., Rehman, K. dan Akash, MS Tinjauan faktor risiko tumor otak dan intervensi terapeutik utama.Ilmu biomedis.Apoteker.143, 112119 (2021).
Kato, I., Zhang, J. & Sun, J. Interaksi bakteri-virus pada kanker saluran pencernaan orodigestif manusia dan wanita: Ringkasan bukti epidemiologi dan laboratorium. Kato, I., Zhang, J. & Sun, J. Interaksi bakteri-virus pada kanker saluran pencernaan orodigestif manusia dan wanita: Ringkasan bukti epidemiologi dan laboratorium.Kato I., Zhang J. dan Sun J. Interaksi bakteri-virus pada kanker saluran pencernaan manusia dan saluran kelamin wanita: ringkasan data epidemiologi dan laboratorium. Kato, I., Zhang, J. & Sun, J. 人类口腔消化道癌和女性生殖道癌中的细菌-病毒相互作用：流行病学和实验室证总结。 Kato, I., Zhang, J. & Sun, J. Interaksi bakterio-virus dalam pencernaan rongga mulut manusia dan saluran reproduksi wanita: ringkasan ilmu penyakit populer dan bukti laboratorium.Kato I., Zhang J. dan Sun J. Interaksi bakteri-virus pada kanker gastrointestinal manusia dan kanker genital wanita: ringkasan data epidemiologi dan laboratorium.Kanker 14, 425 (2022).
Magon, KL & Parish, JL Dari infeksi menjadi kanker: Bagaimana virus tumor DNA mengubah pusat metabolisme karbon dan lipid sel inang. Magon, KL & Parish, JL Dari infeksi menjadi kanker: Bagaimana virus tumor DNA mengubah pusat metabolisme karbon dan lipid sel inang.Mahon, KL dan Parish, JL Menimbulkan infeksi kanker: bagaimana virus tumor berbasis DNA mengubah pusat karbon dan metabolisme lipid sel inang. Magon, KL & Parish, JL 从感染到癌症：DNA 肿瘤病毒如何改变宿主细胞的中心碳和脂质代谢。 Magon, KL & Parish, JL Dari infeksi hingga kanker: bagaimana virus tumor DNA mengubah pusat metabolisme karbon dan lipid sel inang.Mahon, KL dan Parish, JL Menimbulkan infeksi kanker: bagaimana virus tumor DNA mengubah pusat metabolisme karbon dan lipid dalam sel inang.Buka Biologi.11, 210004 (2021).
Correia da Costa, JM dkk.Estrogen katekol dari schistosomes dan cacing hati serta kanker terkait cacing.depan.panas di dalam.5, 444 (2014).