Terima kasih telah mengunjungi Nature.com.Versi browser yang Anda gunakan memiliki dukungan CSS yang terbatas.Untuk pengalaman terbaik, kami menyarankan Anda menggunakan browser yang diperbarui (atau menonaktifkan Mode Kompatibilitas di Internet Explorer).Sementara itu, untuk memastikan dukungan berkelanjutan, kami akan merender situs tanpa gaya dan JavaScript.
Vektor gen untuk pengobatan fibrosis kistik paru harus ditargetkan pada saluran udara konduktif, karena transduksi paru perifer tidak memiliki efek terapeutik.Efisiensi transduksi virus berhubungan langsung dengan waktu tinggal pembawa.Namun, cairan penghantar seperti pembawa gen secara alami berdifusi ke dalam alveoli selama inhalasi, dan partikel terapeutik dalam bentuk apa pun dengan cepat dihilangkan melalui transpor mukosiliar.Memperpanjang waktu tinggal pembawa gen di saluran pernapasan merupakan hal yang penting namun sulit dicapai.Partikel magnetik terkonjugasi pembawa yang dapat diarahkan ke permukaan saluran pernapasan dapat meningkatkan penargetan regional.Karena masalah pada pencitraan in vivo, perilaku partikel magnetik kecil pada permukaan saluran napas dengan adanya medan magnet masih kurang dipahami.Tujuan dari penelitian ini adalah menggunakan pencitraan sinkrotron untuk memvisualisasikan pergerakan serangkaian partikel magnetik di trakea tikus yang dianestesi secara in vivo untuk mempelajari dinamika dan pola perilaku partikel tunggal dan massal secara in vivo.Kami kemudian juga menilai apakah pengiriman partikel magnetik lentiviral dengan adanya medan magnet akan meningkatkan efisiensi transduksi pada trakea tikus.Pencitraan sinar-X Synchrotron menunjukkan perilaku partikel magnetik dalam medan magnet diam dan bergerak secara in vitro dan in vivo.Partikel tidak dapat dengan mudah diseret melintasi permukaan saluran udara hidup menggunakan magnet, tetapi selama pengangkutan, endapan terkonsentrasi di bidang pandang, yang medan magnetnya paling kuat.Efisiensi transduksi juga meningkat enam kali lipat ketika partikel magnet lentiviral dikirimkan dengan adanya medan magnet.Secara keseluruhan, hasil ini menunjukkan bahwa partikel magnetik lentiviral dan medan magnet mungkin merupakan pendekatan yang berharga untuk meningkatkan penargetan vektor gen dan tingkat transduksi dalam saluran udara konduktif secara in vivo.
Fibrosis kistik (CF) disebabkan oleh variasi dalam satu gen yang disebut regulator konduktansi transmembran CF (CFTR).Protein CFTR adalah saluran ion yang terdapat di banyak sel epitel di seluruh tubuh, termasuk saluran udara, tempat utama dalam patogenesis fibrosis kistik.Cacat pada CFTR menyebabkan transportasi air tidak normal, dehidrasi permukaan saluran napas, dan penurunan kedalaman lapisan cairan permukaan saluran napas (ASL).Hal ini juga mengganggu kemampuan sistem transportasi mukosiliar (MCT) untuk membersihkan saluran udara dari partikel dan patogen yang terhirup.Tujuan kami adalah mengembangkan terapi gen lentiviral (LV) untuk menghasilkan salinan gen CFTR yang benar dan meningkatkan ASL, MCT, dan kesehatan paru-paru, serta terus mengembangkan teknologi baru yang dapat mengukur parameter ini secara in vivo1.
Vektor LV adalah salah satu kandidat utama untuk terapi gen fibrosis kistik, terutama karena vektor tersebut dapat secara permanen mengintegrasikan gen terapeutik ke dalam sel basal saluran napas (sel induk saluran napas).Hal ini penting karena obat ini dapat mengembalikan hidrasi normal dan pembersihan lendir dengan berdiferensiasi menjadi sel permukaan saluran napas fungsional yang terkoreksi gen terkait dengan fibrosis kistik, sehingga memberikan manfaat seumur hidup.Vektor LV harus diarahkan terhadap saluran udara konduktif, karena di sinilah keterlibatan paru pada CF dimulai.Pengiriman vektor lebih dalam ke paru-paru dapat menyebabkan transduksi alveolar, namun hal ini tidak memiliki efek terapeutik pada fibrosis kistik.Namun, cairan seperti pembawa gen secara alami bermigrasi ke alveoli ketika dihirup setelah melahirkan3,4 dan partikel terapeutik dengan cepat dikeluarkan ke dalam rongga mulut melalui MCT.Efisiensi transduksi LV berhubungan langsung dengan lamanya waktu vektor tetap dekat dengan sel target untuk memungkinkan serapan seluler – “waktu tinggal”5 yang dapat dengan mudah dipersingkat dengan aliran udara regional yang khas serta serapan lendir dan partikel MCT yang terkoordinasi.Untuk fibrosis kistik, kemampuan untuk memperpanjang waktu tinggal LV di saluran udara penting untuk mencapai tingkat transduksi yang tinggi di area ini, namun sejauh ini merupakan suatu tantangan.
Untuk mengatasi rintangan ini, kami mengusulkan agar partikel magnetik LV (MP) dapat membantu dalam dua cara yang saling melengkapi.Pertama, mereka dapat dipandu oleh magnet ke permukaan saluran napas untuk meningkatkan penargetan dan membantu partikel pembawa gen berada di area saluran napas yang tepat;dan ASL) berpindah ke lapisan sel 6. MP banyak digunakan sebagai sarana penghantaran obat yang ditargetkan ketika mereka berikatan dengan antibodi, obat kemoterapi, atau molekul kecil lainnya yang menempel pada membran sel atau berikatan dengan reseptor permukaan sel masing-masing dan terakumulasi di lokasi tumor di adanya listrik statis.Medan magnet untuk terapi kanker 7. Metode “hipertermik” lainnya ditujukan untuk membunuh sel tumor dengan memanaskan MP ketika terkena medan magnet yang berosilasi.Prinsip transfeksi magnetik, di mana medan magnet digunakan sebagai agen transfeksi untuk meningkatkan transfer DNA ke dalam sel, umumnya digunakan secara in vitro menggunakan serangkaian vektor gen non-virus dan virus untuk garis sel yang sulit ditransduksi. ..Efisiensi magnetotransfeksi LV dengan pengiriman LV MP in vitro ke dalam garis sel epitel bronkial manusia dengan adanya medan magnet statis telah ditetapkan, meningkatkan efisiensi transduksi sebesar 186 kali dibandingkan dengan vektor LV saja.LV MT juga telah diterapkan pada model fibrosis kistik in vitro, di mana transfeksi magnetik meningkatkan transduksi LV dalam kultur antarmuka udara-cair sebanyak 20 kali lipat dengan adanya sputum fibrosis kistik10.Namun, transfeksi magnet organ in vivo hanya mendapat sedikit perhatian dan hanya dievaluasi pada beberapa penelitian pada hewan11,12,13,14,15, terutama pada paru-paru16,17.Namun, kemungkinan transfeksi magnetik dalam terapi paru pada fibrosis kistik sudah jelas.Tan dkk.(2020) menyatakan bahwa “studi validasi pada pengiriman nanopartikel magnetik yang efektif ke paru akan membuka jalan bagi strategi inhalasi CFTR di masa depan untuk meningkatkan hasil klinis pada pasien dengan fibrosis kistik”6.
Perilaku partikel magnet kecil pada permukaan saluran pernapasan dengan adanya medan magnet sulit untuk divisualisasikan dan dipelajari, sehingga kurang dipahami.Dalam penelitian lain, kami telah mengembangkan metode Pencitraan X-Ray Kontras Fase Berbasis Propagasi Synchrotron (PB-PCXI) untuk pencitraan non-invasif dan kuantifikasi perubahan menit in vivo pada kedalaman ASL18 dan perilaku MCT19,20 untuk mengukur secara langsung hidrasi permukaan saluran gas dan digunakan sebagai indikator awal efektivitas pengobatan.Selain itu, metode penilaian MCT kami menggunakan partikel berdiameter 10–35 µm yang terdiri dari alumina atau kaca indeks bias tinggi sebagai penanda MCT yang terlihat dengan PB-PCXI21.Kedua metode ini cocok untuk pencitraan berbagai jenis partikel, termasuk MP.
Karena resolusi spasial dan temporal yang tinggi, pengujian ASL dan MCT berbasis PB-PCXI kami sangat cocok untuk mempelajari dinamika dan pola perilaku partikel tunggal dan massal in vivo untuk membantu kami memahami dan mengoptimalkan metode pengiriman gen MP.Pendekatan yang kami gunakan di sini didasarkan pada penelitian kami menggunakan beamline SPring-8 BL20B2, di mana kami memvisualisasikan pergerakan cairan setelah pemberian dosis vektor tiruan ke saluran udara hidung dan paru tikus untuk membantu menjelaskan pola ekspresi gen heterogen yang kami amati. dalam gen kita.penelitian pada hewan dengan dosis pembawa 3,4.
Tujuan dari penelitian ini adalah menggunakan sinkrotron PB-PCXI untuk memvisualisasikan pergerakan in vivo serangkaian anggota parlemen di trakea tikus hidup.Studi pencitraan PB-PCXI ini dirancang untuk menguji seri MP, kekuatan medan magnet, dan lokasi untuk menentukan pengaruhnya terhadap pergerakan MP.Kami berasumsi bahwa medan magnet eksternal akan membantu MF yang dikirimkan tetap atau berpindah ke area target.Studi-studi ini juga memungkinkan kami untuk menentukan konfigurasi magnet yang memaksimalkan jumlah partikel yang tersisa di trakea setelah pengendapan.Dalam penelitian seri kedua, kami bertujuan untuk menggunakan konfigurasi optimal ini untuk menunjukkan pola transduksi yang dihasilkan dari pengiriman LV-MP secara in vivo ke saluran napas tikus, dengan asumsi bahwa pengiriman LV-MP dalam konteks penargetan saluran napas akan menghasilkan dalam meningkatkan efisiensi transduksi LV..
Semua penelitian pada hewan dilakukan sesuai dengan protokol yang disetujui oleh Universitas Adelaide (M-2019-060 dan M-2020-022) dan Komite Etika Hewan Synchrotron SPring-8.Percobaan dilakukan sesuai dengan rekomendasi ARRIVE.
Semua gambar x-ray diambil pada beamline BL20XU di sinkrotron SPring-8 di Jepang menggunakan pengaturan yang mirip dengan yang dijelaskan sebelumnya21,22.Singkatnya, kotak percobaan terletak 245 m dari cincin penyimpanan sinkrotron.Jarak sampel-ke-detektor 0,6 m digunakan untuk studi pencitraan partikel dan 0,3 m untuk studi pencitraan in vivo guna menciptakan efek kontras fase.Sinar monokromatik dengan energi 25 keV digunakan.Gambar diperoleh menggunakan transduser sinar-X resolusi tinggi (SPring-8 BM3) yang digabungkan dengan detektor sCMOS.Transduser mengubah sinar-X menjadi cahaya tampak menggunakan sintilator setebal 10 µm (Gd3Al2Ga3O12), yang kemudian diarahkan ke sensor sCMOS menggunakan objektif mikroskop ×10 (NA 0,3).Detektor sCMOS adalah Orca-Flash4.0 (Hamamatsu Photonics, Jepang) dengan ukuran array 2048 × 2048 piksel dan ukuran piksel mentah 6,5 × 6,5 µm.Pengaturan ini memberikan ukuran piksel isotropik efektif sebesar 0,51 µm dan bidang pandang sekitar 1,1 mm × 1,1 mm.Durasi paparan 100 ms dipilih untuk memaksimalkan rasio sinyal terhadap kebisingan partikel magnetik di dalam dan di luar saluran udara sekaligus meminimalkan artefak gerakan yang disebabkan oleh pernapasan.Untuk penelitian in vivo, rana sinar-X cepat ditempatkan di jalur sinar-X untuk membatasi dosis radiasi dengan memblokir sinar sinar-X di antara paparan.
Media LV tidak digunakan dalam studi pencitraan SPring-8 PB-PCXI karena ruang pencitraan BL20XU tidak bersertifikat Keamanan Hayati Tingkat 2.Sebaliknya, kami memilih serangkaian MP yang berkarakter baik dari dua vendor komersial yang mencakup berbagai ukuran, bahan, konsentrasi besi, dan aplikasi, - pertama untuk memahami bagaimana medan magnet mempengaruhi pergerakan MP di kapiler kaca, dan kemudian di saluran udara hidup.permukaan.Ukuran MP bervariasi dari 0,25 hingga 18 µm dan terbuat dari berbagai bahan (lihat Tabel 1), namun komposisi setiap sampel, termasuk ukuran partikel magnetik dalam MP, tidak diketahui.Berdasarkan studi MCT ekstensif kami 19, 20, 21, 23, 24, kami memperkirakan bahwa MP dengan ukuran hingga 5 µm dapat terlihat pada permukaan saluran napas trakea, misalnya, dengan mengurangi frame berturut-turut untuk melihat peningkatan visibilitas pergerakan MP.MP tunggal sebesar 0,25 µm lebih kecil dari resolusi perangkat pencitraan, namun PB-PCXI diharapkan dapat mendeteksi kontras volumetrik dan pergerakan cairan permukaan tempat mereka disimpan setelah diendapkan.
Sampel untuk setiap anggota parlemen dalam tabel.1 dibuat dalam kapiler kaca 20 μl (Drummond Microcaps, PA, USA) dengan diameter internal 0,63 mm.Partikel korpuskular tersedia dalam air, sedangkan partikel CombiMag tersedia dalam cairan milik produsen.Setiap tabung diisi setengahnya dengan cairan (kira-kira 11 μl) dan ditempatkan pada tempat sampel (lihat Gambar 1).Kapiler kaca masing-masing ditempatkan secara horizontal di atas panggung di ruang pencitraan, dan diposisikan di tepi cairan.Magnet cangkang nikel berdiameter 19 mm (panjang 28 mm) yang terbuat dari tanah jarang, neodymium, besi dan boron (NdFeB) (N35, cat. no. LM1652, Jaycar Electronics, Australia) dengan remanensi 1,17 T dipasang pada a tabel transfer terpisah untuk mencapai Ubah posisi Anda dari jarak jauh selama rendering.Pencitraan sinar-X dimulai ketika magnet diposisikan kira-kira 30 mm di atas sampel dan gambar diperoleh dengan kecepatan 4 frame per detik.Selama pencitraan, magnet didekatkan ke tabung kapiler kaca (pada jarak sekitar 1 mm) dan kemudian dipindahkan sepanjang tabung untuk menilai pengaruh kekuatan medan dan posisi.
Pengaturan pencitraan in vitro yang berisi sampel MP dalam kapiler kaca pada tahap penerjemahan sampel xy.Jalur pancaran sinar X ditandai dengan garis putus-putus berwarna merah.
Setelah visibilitas in vitro dari anggota parlemen ditetapkan, sebagian dari mereka diuji secara in vivo pada tikus Wistar albino betina tipe liar (~12 minggu, ~200 g).Medetomidine 0,24 mg/kg (Domitor®, Zenoaq, Jepang), midazolam 3,2 mg/kg (Dormicum®, Astellas Pharma, Jepang) dan butorphanol 4 mg/kg (Vetorphale®, Meiji Seika).Tikus dibius dengan campuran Pharma (Jepang) dengan injeksi intraperitoneal.Setelah anestesi, mereka dipersiapkan untuk pencitraan dengan menghilangkan bulu di sekitar trakea, memasukkan tabung endotrakeal (ET; kanula intravena 16 Ga, Terumo BCT), dan melumpuhkan mereka dalam posisi terlentang pada pelat pencitraan yang dibuat khusus yang berisi kantong termal. untuk menjaga suhu tubuh.22. Pelat pencitraan kemudian ditempelkan pada tahap sampel di kotak pencitraan dengan sedikit miring untuk menyelaraskan trakea secara horizontal pada gambar x-ray seperti yang ditunjukkan pada Gambar 2a.
(a) Pengaturan pencitraan in vivo di unit pencitraan SPring-8, jalur berkas sinar-X ditandai dengan garis putus-putus merah.(b, c) Lokalisasi magnet trakea dilakukan dari jarak jauh menggunakan dua kamera IP yang dipasang secara ortogonal.Di sisi kiri gambar di layar, Anda dapat melihat lingkaran kawat yang menahan kepala dan kanula persalinan dipasang di dalam tabung ET.
Sistem pompa jarum suntik yang dikendalikan dari jarak jauh (UMP2, World Precision Instruments, Sarasota, FL) menggunakan jarum suntik kaca 100 μl dihubungkan ke pipa PE10 (OD 0,61 mm, ID 0,28 mm) menggunakan jarum 30 Ga.Tandai selang untuk memastikan ujungnya berada pada posisi yang benar di trakea saat memasukkan selang endotrakeal.Dengan menggunakan pompa mikro, alat suntik dilepas dan ujung tabung direndam dalam sampel MP yang akan dikirim.Tabung pengantar yang telah diisi kemudian dimasukkan ke dalam tabung endotrakeal, menempatkan ujungnya pada bagian terkuat dari medan magnet yang diharapkan.Akuisisi gambar dikontrol menggunakan detektor napas yang terhubung ke kotak waktu berbasis Arduino kami, dan semua sinyal (misalnya suhu, pernapasan, rana buka/tutup, dan akuisisi gambar) direkam menggunakan Powerlab dan LabChart (AD Instruments, Sydney, Australia) 22 Saat Pencitraan Saat wadah tidak tersedia, dua kamera IP (Panasonic BB-SC382) diposisikan sekitar 90° satu sama lain dan digunakan untuk mengontrol posisi magnet relatif terhadap trakea selama pencitraan (Gambar 2b, c).Untuk meminimalkan artefak gerakan, satu gambar per napas diperoleh selama dataran tinggi aliran pernapasan terminal.
Magnet dipasang pada tahap kedua, yang mungkin terletak jauh di bagian luar badan pencitraan.Berbagai posisi dan konfigurasi magnet diuji, termasuk: ditempatkan pada sudut kira-kira 30° di atas trakea (konfigurasi ditunjukkan pada Gambar 2a dan 3a);satu magnet di atas hewan dan magnet lainnya di bawah, dengan kutub dipasang sebagai daya tarik (Gambar 3b)., satu magnet di atas hewan dan satu di bawah, dengan kutub diatur untuk tolakan (Gambar 3c), dan satu magnet di atas dan tegak lurus terhadap trakea (Gambar 3d).Setelah menyiapkan hewan dan magnet serta memasukkan MP yang diuji ke dalam pompa jarum suntik, berikan dosis 50 μl dengan kecepatan 4 μl/detik setelah memperoleh gambar.Magnet kemudian digerakkan maju mundur sepanjang atau melintasi trakea sambil terus memperoleh gambar.
Konfigurasi magnet untuk pencitraan in vivo (a) satu magnet di atas trakea dengan sudut kira-kira 30°, (b) dua magnet dikonfigurasi untuk tarik-menarik, (c) dua magnet dikonfigurasi untuk tolakan, (d) satu magnet di atas dan tegak lurus terhadap batang tenggorok.Pengamat melihat ke bawah dari mulut ke paru-paru melalui trakea dan sinar X-ray melewati sisi kiri tikus dan keluar dari sisi kanan.Magnet digerakkan sepanjang saluran napas atau ke kiri dan kanan di atas trakea searah dengan pancaran sinar-X.
Kami juga berupaya menentukan visibilitas dan perilaku partikel di saluran udara tanpa adanya pencampuran antara pernapasan dan detak jantung.Oleh karena itu, pada akhir periode pencitraan, hewan di-eutanasia secara manusiawi karena overdosis pentobarbital (Somnopentyl, Pitman-Moore, Washington Crossing, AS; ~65 mg/kg ip).Beberapa hewan tertinggal di platform pencitraan, dan setelah penghentian pernapasan dan detak jantung, proses pencitraan diulangi, menambahkan dosis tambahan MP jika tidak ada MP yang terlihat di permukaan saluran napas.
Gambar yang dihasilkan dikoreksi untuk bidang datar dan gelap dan kemudian dirangkai menjadi film (20 frame per detik; 15–25 × kecepatan normal tergantung pada laju pernapasan) menggunakan skrip khusus yang ditulis dalam MATLAB (R2020a, The Mathworks).
Semua studi tentang pengiriman vektor gen LV dilakukan di Pusat Penelitian Hewan Laboratorium Universitas Adelaide dan bertujuan untuk menggunakan hasil percobaan SPring-8 untuk menilai apakah pengiriman LV-MP dengan adanya medan magnet dapat meningkatkan transfer gen in vivo .Untuk mengevaluasi efek MF dan medan magnet, dua kelompok hewan diberi perlakuan: satu kelompok disuntik dengan LV MF dengan penempatan magnet, dan kelompok lainnya disuntik dengan kelompok kontrol dengan LV MF tanpa magnet.
Vektor gen LV telah dihasilkan menggunakan metode yang telah dijelaskan sebelumnya 25, 26 .Vektor LacZ mengekspresikan gen beta-galaktosidase terlokalisasi nuklir yang digerakkan oleh promotor konstitutif MPSV (LV-LacZ), yang menghasilkan produk reaksi biru dalam sel yang ditransduksi, terlihat di bagian depan dan bagian jaringan paru-paru.Titrasi dilakukan pada kultur sel dengan menghitung secara manual jumlah sel positif LacZ menggunakan hemositometer untuk menghitung titer dalam TU/ml.Pembawa dikriopreservasi pada suhu -80°C, dicairkan sebelum digunakan, dan diikat ke CombiMag dengan mencampurkan 1:1 dan diinkubasi di atas es setidaknya selama 30 menit sebelum dikirim.
Tikus Sprague Dawley normal (n = 3/kelompok, ~2-3 ip dianestesi dengan campuran 0,4mg/kg medetomidine (Domitor, Ilium, Australia) dan 60mg/kg ketamine (Ilium, Australia) pada usia 1 bulan) ip ) injeksi dan kanulasi oral non-bedah dengan kanula intravena 16 Ga.Untuk memastikan bahwa jaringan saluran napas trakea menerima transduksi LV, jaringan tersebut dikondisikan menggunakan protokol gangguan mekanis yang kami jelaskan sebelumnya di mana permukaan saluran napas trakea digosok secara aksial dengan keranjang kawat (N-Circle, ekstraktor batu nitinol tanpa ujung NTSE-022115) -UDH, Cook Medical, AS) 30 hal28.Kemudian, sekitar 10 menit setelah gangguan dalam kabinet keamanan hayati, pemberian LV-MP trakea dilakukan.
Medan magnet yang digunakan dalam percobaan ini dikonfigurasi serupa dengan penelitian x-ray in vivo, dengan magnet yang sama ditahan di trakea dengan klem stent distilasi (Gambar 4).Volume 50 μl (2 x 25 μl alikuot) LV-MP dikirim ke trakea (n = 3 hewan) menggunakan pipet berujung gel seperti dijelaskan sebelumnya.Kelompok kontrol (n = 3 hewan) menerima LV-MP yang sama tanpa menggunakan magnet.Setelah infus selesai, kanula dikeluarkan dari tabung endotrakeal dan hewan diekstubasi.Magnet tetap di tempatnya selama 10 menit sebelum dilepas.Tikus diberi dosis subkutan dengan meloxicam (1 ml/kg) (Ilium, Australia) diikuti dengan penghentian anestesi dengan injeksi intraperitoneal 1 mg/kg atipamazole hidroklorida (Antisedan, Zoetis, Australia).Tikus tetap hangat dan diamati sampai pulih sepenuhnya dari anestesi.
Perangkat pengiriman LV-MP dalam lemari keamanan biologis.Anda dapat melihat bahwa selongsong Luer-lock abu-abu muda dari tabung ET menonjol dari mulut, dan ujung pipet gel yang ditunjukkan pada gambar dimasukkan melalui tabung ET ke kedalaman yang diinginkan ke dalam trakea.
Satu minggu setelah prosedur pemberian LV-MP, hewan dikorbankan secara manusiawi dengan menghirup 100% CO2 dan ekspresi LacZ dinilai menggunakan pengobatan X-gal standar kami.Tiga cincin tulang rawan paling ekor dihilangkan untuk memastikan bahwa kerusakan mekanis atau retensi cairan akibat penempatan tabung endotrakeal tidak akan dimasukkan dalam analisis.Setiap trakea dipotong memanjang untuk mendapatkan dua bagian untuk dianalisis dan ditempatkan dalam cangkir berisi karet silikon (Sylgard, Dow Inc) menggunakan jarum Minutien (Fine Science Tools) untuk memvisualisasikan permukaan lumen.Distribusi dan karakter sel yang ditransduksi dikonfirmasi oleh fotografi frontal menggunakan mikroskop Nikon (SMZ1500) dengan kamera DigiLite dan perangkat lunak TCapture (Tucsen Photonics, China).Gambar diperoleh dengan perbesaran 20x (termasuk pengaturan maksimum untuk lebar penuh trakea), dengan seluruh panjang trakea ditampilkan langkah demi langkah, memberikan tumpang tindih yang cukup antara setiap gambar untuk memungkinkan gambar “dijahit”.Gambar dari masing-masing trakea kemudian digabungkan menjadi satu gambar komposit menggunakan Composite Image Editor versi 2.0.3 (Microsoft Research) menggunakan algoritma gerak planar. Area ekspresi LacZ dalam gambar komposit trakea dari masing-masing hewan diukur menggunakan skrip MATLAB otomatis (R2020a, MathWorks) seperti yang dijelaskan sebelumnya28, menggunakan pengaturan 0,35 <Hue <0,58, Saturasi> 0,15, dan Nilai <0,7. Area ekspresi LacZ dalam gambar komposit trakea dari masing-masing hewan diukur menggunakan skrip MATLAB otomatis (R2020a, MathWorks) seperti yang dijelaskan sebelumnya28, menggunakan pengaturan 0,35 <Hue <0,58, Saturasi> 0,15, dan Nilai <0,7. П lacz в в с составных зображени dengannya тхеи о каждговано hal о я matlab (R2020A, MathWorks), как о описано рн - и - и и - и - и - и о - и - и о - и - и о о - и - и о о о о KAN значение <0 ,7. Area ekspresi LacZ dalam gambar trakea komposit dari masing-masing hewan diukur menggunakan skrip MATLAB otomatis (R2020a, MathWorks) seperti yang dijelaskan sebelumnya28 menggunakan pengaturan 0,350,15 dan nilai<0 ,7.如前所述,使用自动MATLAB 脚本（R2020a，MathWorks）对来自每只动物的气管复合图像中的LacZ 表达区域进行量化,使用0.35 < 色调< 0.58、饱和度> 0.15 和值< 0.7 的设置。如 前所 述 , 自动 自动 Matlab 脚本 （（r2020a , Mathworks） 来自 每 只 的 气管 复合 图像 的 的 的 的 表达 量化 , 使用 使用 使用 0.35 <色调 <0.58 、> 0.15 和值 <0.7 的。。。。。 .................... PANGGUL Области экспресotan lacz на составных зображениях тахеи кажжно живована но kata рованно A ценария matlab (R2020A, MathWorks), ка описано рн - с и 3 и - о - о - о - о о о о о 00, о о о о KAN <0,7 . Area ekspresi LacZ pada gambar komposit trakea masing-masing hewan diukur menggunakan skrip MATLAB otomatis (R2020a, MathWorks) seperti yang dijelaskan sebelumnya menggunakan pengaturan 0,35 < hue < 0,58, saturasi > 0,15 dan nilai <0,7.Dengan melacak kontur jaringan di GIMP v2.10.24, masker dibuat secara manual untuk setiap gambar komposit guna mengidentifikasi area jaringan dan mencegah deteksi palsu di luar jaringan trakea.Area yang diwarnai dari semua gambar komposit dari masing-masing hewan dijumlahkan untuk mendapatkan total area yang diwarnai untuk hewan tersebut.Area yang dicat kemudian dibagi dengan luas total topeng untuk mendapatkan luas normalisasi.
Setiap trakea ditanam dalam parafin dan dibelah setebal 5 µm.Bagian-bagian tersebut diwarnai dengan warna merah cepat netral selama 5 menit dan gambar diperoleh menggunakan mikroskop Nikon Eclipse E400, kamera DS-Fi3 dan perangkat lunak penangkap elemen NIS (versi 5.20.00).
Semua analisis statistik dilakukan di GraphPad Prism v9 (GraphPad Software, Inc.).Signifikansi statistik ditetapkan pada p ≤ 0,05.Normalitas diuji menggunakan uji Shapiro-Wilk dan perbedaan pewarnaan LacZ dinilai menggunakan uji t tidak berpasangan.
Enam MP yang dijelaskan pada Tabel 1 diperiksa oleh PCXI, dan visibilitas dijelaskan pada Tabel 2. Dua MP polistiren (MP1 dan MP2; masing-masing 18 µm dan 0,25 µm) tidak terlihat oleh PCXI, namun sampel yang tersisa dapat diidentifikasi (contoh ditunjukkan pada Gambar 5).MP3 dan MP4 terlihat lemah (10-15% Fe3O4; masing-masing 0,25 µm dan 0,9 µm).Meskipun MP5 (98% Fe3O4; 0,25 µm) mengandung beberapa partikel terkecil yang diuji, namun partikel tersebut merupakan yang paling menonjol.Produk CombiMag MP6 sulit dibedakan.Dalam semua kasus, kemampuan kita untuk mendeteksi MF meningkat pesat dengan menggerakkan magnet bolak-balik sejajar dengan kapiler.Ketika magnet menjauh dari kapiler, partikel-partikel tersebut ditarik keluar dalam rantai panjang, tetapi ketika magnet mendekat dan kekuatan medan magnet meningkat, rantai partikel memendek ketika partikel-partikel tersebut bermigrasi menuju permukaan atas kapiler (lihat Video Tambahan S1 : MP4), meningkatkan kepadatan partikel di permukaan.Sebaliknya, ketika magnet dikeluarkan dari kapiler, kekuatan medan berkurang dan anggota parlemen tersusun ulang menjadi rantai panjang yang memanjang dari permukaan atas kapiler (lihat Video Tambahan S2: MP4).Setelah magnet berhenti bergerak, partikel terus bergerak selama beberapa waktu setelah mencapai posisi setimbang.Saat MP bergerak menuju dan menjauhi permukaan atas kapiler, partikel magnet cenderung menarik serpihan melalui cairan.
Visibilitas MP di bawah PCXI sangat bervariasi antar sampel.(a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 dan (d) MP6.Semua gambar yang ditampilkan di sini diambil dengan magnet yang diposisikan kira-kira 10 mm tepat di atas kapiler.Lingkaran besar yang tampak adalah gelembung udara yang terperangkap di kapiler, dengan jelas menunjukkan fitur tepi hitam dan putih dari gambar fase kontras.Kotak merah menunjukkan perbesaran yang meningkatkan kontras.Perhatikan bahwa diameter sirkuit magnet pada semua gambar tidak sesuai skala dan kira-kira 100 kali lebih besar dari yang ditunjukkan.
Saat magnet bergerak ke kiri dan kanan sepanjang bagian atas kapiler, sudut string MP berubah sejajar dengan magnet (lihat Gambar 6), sehingga menggambarkan garis-garis medan magnet.Untuk MP3-5, setelah tali busur mencapai sudut ambang batas, partikel terseret sepanjang permukaan atas kapiler.Hal ini sering kali mengakibatkan anggota parlemen berkumpul menjadi kelompok yang lebih besar di dekat tempat yang medan magnetnya paling kuat (lihat Video Tambahan S3: MP5).Hal ini juga terlihat jelas ketika pencitraan dekat dengan ujung kapiler, yang menyebabkan MP berkumpul dan terkonsentrasi pada antarmuka cair-udara.Partikel-partikel dalam MP6, yang lebih sulit dibedakan dibandingkan dengan MP3-5, tidak terseret ketika magnet bergerak di sepanjang kapiler, tetapi string MP terdisosiasi, meninggalkan partikel-partikel tersebut dalam pandangan (lihat Video Tambahan S4: MP6).Dalam beberapa kasus, ketika medan magnet yang diterapkan dikurangi dengan menggerakkan magnet jauh dari lokasi pencitraan, anggota parlemen yang tersisa perlahan-lahan turun ke permukaan bawah tabung karena gravitasi, tetap berada dalam string (lihat Video Tambahan S5: MP3) .
Sudut senar MP berubah ketika magnet bergerak ke kanan di atas kapiler.(a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 dan (d) MP6.Kotak merah menunjukkan perbesaran yang meningkatkan kontras.Harap dicatat bahwa video tambahan ini bertujuan untuk memberikan informasi karena mengungkapkan struktur partikel penting dan informasi dinamis yang tidak dapat divisualisasikan dalam gambar statis ini.
Pengujian kami menunjukkan bahwa menggerakkan magnet maju mundur secara perlahan di sepanjang trakea memfasilitasi visualisasi MF dalam konteks gerakan kompleks in vivo.Tidak ada pengujian in vivo yang dilakukan karena butiran polistiren (MP1 dan MP2) tidak terlihat di kapiler.Masing-masing dari empat MF yang tersisa diuji secara in vivo dengan sumbu panjang magnet diposisikan di atas trakea dengan sudut sekitar 30° terhadap vertikal (lihat Gambar 2b dan 3a), karena hal ini menghasilkan rantai MF yang lebih panjang dan lebih efektif. daripada magnet..konfigurasi dihentikan.MP3, MP4 dan MP6 belum ditemukan pada trakea hewan hidup manapun.Ketika memvisualisasikan saluran pernapasan tikus setelah membunuh hewan tersebut secara manusiawi, partikel-partikel tersebut tetap tidak terlihat bahkan ketika volume tambahan ditambahkan menggunakan pompa jarum suntik.MP5 memiliki kandungan oksida besi tertinggi dan merupakan satu-satunya partikel yang terlihat, sehingga digunakan untuk mengevaluasi dan mengkarakterisasi perilaku MP in vivo.
Penempatan magnet di atas trakea selama penyisipan MF mengakibatkan banyak, namun tidak semua, MF terkonsentrasi pada bidang pandang.Masuknya partikel melalui trakea paling baik diamati pada hewan yang di-eutanasia secara manusiawi.Gambar 7 dan Video Tambahan S6: MP5 menunjukkan penangkapan magnetik yang cepat dan penyelarasan partikel pada permukaan ventral trakea, menunjukkan bahwa anggota parlemen dapat ditargetkan ke area trakea yang diinginkan.Saat mencari lebih jauh di sepanjang trakea setelah pemberian MF, beberapa MF ditemukan lebih dekat ke karina, yang menunjukkan kekuatan medan magnet yang tidak mencukupi untuk mengumpulkan dan menahan semua MF, karena MF dikirimkan melalui wilayah dengan kekuatan medan magnet maksimum selama pemberian cairan.proses.Namun, konsentrasi MP pascakelahiran lebih tinggi di sekitar area gambar, menunjukkan bahwa banyak MP tetap berada di wilayah saluran napas di mana kekuatan medan magnet yang diterapkan paling tinggi.
Gambar (a) sebelum dan (b) setelah pemberian MP5 ke dalam trakea tikus yang baru saja di-eutanasia dengan magnet ditempatkan tepat di atas area pencitraan.Area yang digambarkan terletak di antara dua cincin tulang rawan.Ada sedikit cairan di saluran napas sebelum MP diberikan.Kotak merah menunjukkan perbesaran yang meningkatkan kontras.Gambar-gambar ini diambil dari video yang ditampilkan di S6: Video Tambahan MP5.
Memindahkan magnet di sepanjang trakea secara in vivo mengakibatkan perubahan sudut rantai MP pada permukaan saluran napas, serupa dengan yang diamati pada kapiler (lihat Gambar 8 dan Video Tambahan S7: MP5).Namun, dalam penelitian kami, anggota parlemen tidak dapat terseret ke permukaan saluran pernafasan hidup, seperti yang dapat dilakukan oleh kapiler.Dalam beberapa kasus, rantai MP memanjang seiring pergerakan magnet ke kiri dan ke kanan.Menariknya, kami juga menemukan bahwa rantai partikel mengubah kedalaman lapisan permukaan cairan ketika magnet digerakkan secara longitudinal sepanjang trakea, dan mengembang ketika magnet digerakkan tepat di atas kepala dan rantai partikel diputar ke posisi vertikal (lihat Video Tambahan S7).: MP5 pada 0:09, kanan bawah).Pola pergerakan karakteristik berubah ketika magnet digerakkan secara lateral melintasi bagian atas trakea (yaitu ke kiri atau kanan hewan, bukan sepanjang trakea).Partikel-partikel tersebut masih terlihat jelas selama pergerakannya, namun ketika magnet dilepas dari trakea, ujung untaian partikel menjadi terlihat (lihat Video Tambahan S8: MP5, mulai dari 0:08).Hal ini sesuai dengan perilaku medan magnet yang diamati di bawah aksi medan magnet yang diterapkan dalam kapiler kaca.
Contoh gambar yang menunjukkan MP5 di trakea tikus hidup yang dibius.(a) Magnet digunakan untuk mengambil gambar di atas dan di sebelah kiri trakea, kemudian (b) setelah magnet digerakkan ke kanan.Kotak merah menunjukkan perbesaran yang meningkatkan kontras.Gambar-gambar ini berasal dari video yang ditampilkan dalam Video Tambahan S7: MP5.
Ketika kedua kutub disetel dalam orientasi utara-selatan di atas dan di bawah trakea (yaitu, menarik; Gambar 3b), akord MP tampak lebih panjang dan terletak di dinding lateral trakea daripada di permukaan dorsal trakea. trakea (lihat Lampiran).Video S9:MP5).Namun, konsentrasi partikel yang tinggi pada satu tempat (yaitu permukaan dorsal trakea) tidak terdeteksi setelah pemberian cairan menggunakan perangkat magnet ganda, yang biasanya terjadi dengan perangkat magnet tunggal.Kemudian, ketika satu magnet dikonfigurasi untuk menolak kutub yang berlawanan (Gambar 3c), jumlah partikel yang terlihat di bidang pandang tidak bertambah setelah pengiriman.Menyiapkan kedua konfigurasi magnet merupakan tantangan karena kekuatan medan magnet tinggi yang menarik atau mendorong magnet masing-masing.Pengaturannya kemudian diubah menjadi magnet tunggal yang sejajar dengan saluran udara tetapi melewati saluran udara dengan sudut 90 derajat sehingga garis gaya melintasi dinding trakea secara ortogonal (Gambar 3d), suatu orientasi yang dimaksudkan untuk menentukan kemungkinan agregasi partikel pada dinding lateral.dilihat.Namun, dalam konfigurasi ini, tidak ada pergerakan akumulasi MF atau pergerakan magnet yang dapat diidentifikasi.Berdasarkan semua hasil ini, konfigurasi dengan magnet tunggal dan orientasi 30 derajat dipilih untuk studi pembawa gen in vivo (Gambar 3a).
Ketika hewan tersebut dicitrakan beberapa kali segera setelah dikorbankan secara manusiawi, tidak adanya gangguan gerakan jaringan berarti bahwa garis partikel yang lebih halus dan pendek dapat terlihat di bidang antar tulang rawan yang jelas, 'bergoyang' sesuai dengan gerakan translasi magnet.melihat dengan jelas keberadaan dan pergerakan partikel MP6.
Titer LV-LacZ adalah 1,8 x 108 IU/mL, dan setelah pencampuran 1:1 dengan CombiMag MP (MP6), hewan disuntik dengan 50 μl dosis trakea 9 x 107 IU/ml kendaraan LV (yaitu 4,5 x 106 TU/tikus).).).Dalam penelitian ini, alih-alih menggerakkan magnet selama persalinan, kami memasang magnet pada satu posisi untuk menentukan apakah transduksi LV dapat (a) ditingkatkan dibandingkan dengan penyampaian vektor tanpa adanya medan magnet, dan (b) apakah saluran napas dapat menjadi fokus.Sel-sel ditransduksi di area target magnetis pada saluran pernapasan bagian atas.
Kehadiran magnet dan penggunaan CombiMag dalam kombinasi dengan vektor LV tampaknya tidak berdampak buruk terhadap kesehatan hewan, seperti halnya protokol pengiriman vektor LV standar kami.Gambar frontal dari daerah trakea yang mengalami gangguan mekanis (Gambar Tambahan 1) menunjukkan bahwa kelompok yang diberi perlakuan LV-MP memiliki tingkat transduksi yang jauh lebih tinggi dengan adanya magnet (Gambar 9a).Hanya sedikit pewarnaan LacZ biru yang terdapat pada kelompok kontrol (Gambar 9b).Kuantifikasi daerah normalisasi bernoda X-Gal menunjukkan bahwa pemberian LV-MP dengan adanya medan magnet menghasilkan peningkatan sekitar 6 kali lipat (Gambar 9c).
Contoh gambar komposit yang menunjukkan transduksi trakea dengan LV-MP (a) dengan adanya medan magnet dan (b) tanpa adanya magnet.(c) Peningkatan yang signifikan secara statistik pada area normal transduksi LacZ di trakea dengan penggunaan magnet (*p = 0,029, uji-t, n = 3 per kelompok, rata-rata ± kesalahan standar rata-rata).
Bagian bernoda merah cepat yang netral (contoh ditunjukkan pada Gambar Tambahan 2) menunjukkan bahwa sel-sel yang diwarnai LacZ terdapat dalam sampel yang sama dan di lokasi yang sama seperti yang dilaporkan sebelumnya.
Tantangan utama dalam terapi gen saluran napas tetap pada lokalisasi yang tepat dari partikel pembawa di area yang diinginkan dan pencapaian efisiensi transduksi tingkat tinggi di paru-paru bergerak dengan adanya aliran udara dan pembersihan lendir aktif.Untuk pembawa LV yang ditujukan untuk pengobatan penyakit pernafasan pada fibrosis kistik, meningkatkan waktu tinggal partikel pembawa di saluran pernafasan konduktif sampai saat ini merupakan tujuan yang tidak dapat dicapai.Seperti yang ditunjukkan oleh Castellani dkk., penggunaan medan magnet untuk meningkatkan transduksi memiliki keunggulan dibandingkan metode pengiriman gen lainnya seperti elektroporasi karena dapat menggabungkan kesederhanaan, ekonomi, pengiriman lokal, peningkatan efisiensi, dan waktu inkubasi yang lebih singkat.dan mungkin dosis kendaraan yang lebih rendah10.Namun, deposisi in vivo dan perilaku partikel magnetik di saluran udara di bawah pengaruh gaya magnet eksternal belum pernah dijelaskan, dan faktanya kemampuan metode ini untuk meningkatkan tingkat ekspresi gen di saluran udara hidup yang utuh belum dibuktikan secara in vivo.
Eksperimen in vitro kami pada sinkrotron PCXI menunjukkan bahwa semua partikel yang kami uji, kecuali polistiren MP, terlihat dalam pengaturan pencitraan yang kami gunakan.Dengan adanya medan magnet, medan magnet membentuk string, yang panjangnya berhubungan dengan jenis partikel dan kekuatan medan magnet (yaitu kedekatan dan pergerakan magnet).Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 10, string yang kita amati terbentuk ketika setiap partikel menjadi termagnetisasi dan menginduksi medan magnet lokalnya sendiri.Medan-medan terpisah ini menyebabkan partikel-partikel serupa lainnya berkumpul dan terhubung dengan gerakan string kelompok karena gaya-gaya lokal dari gaya-gaya lokal tarik-menarik dan tolak-menolak partikel-partikel lain.
Diagram menunjukkan (a, b) rantai partikel yang terbentuk di dalam kapiler berisi cairan dan (c, d) trakea berisi udara.Perhatikan bahwa kapiler dan trakea tidak digambarkan sesuai skala.Panel (a) juga berisi deskripsi MF yang mengandung partikel Fe3O4 yang tersusun dalam rantai.
Ketika magnet bergerak melewati kapiler, sudut string partikel mencapai ambang kritis untuk MP3-5 yang mengandung Fe3O4, setelah itu string partikel tidak lagi berada pada posisi semula, tetapi bergerak sepanjang permukaan ke posisi baru.magnet.Efek ini kemungkinan besar terjadi karena permukaan kapiler kaca cukup halus untuk memungkinkan terjadinya pergerakan ini.Menariknya, MP6 (CombiMag) tidak berperilaku seperti ini, mungkin karena partikelnya lebih kecil, memiliki lapisan atau muatan permukaan yang berbeda, atau cairan pembawa mempengaruhi kemampuannya untuk bergerak.Kontras pada gambar partikel CombiMag juga lebih lemah, menunjukkan bahwa cairan dan partikel mungkin memiliki kepadatan yang sama sehingga tidak dapat bergerak dengan mudah ke arah satu sama lain.Partikel juga dapat tersangkut jika magnet bergerak terlalu cepat, hal ini menunjukkan bahwa kuat medan magnet tidak selalu dapat mengatasi gesekan antar partikel dalam fluida, hal ini menunjukkan bahwa kuat medan magnet dan jarak antara magnet dan area target tidak boleh menjadi sama. kejutan.penting.Hasil ini juga menunjukkan bahwa meskipun magnet dapat menangkap banyak mikropartikel yang mengalir melalui area target, kecil kemungkinannya magnet dapat diandalkan untuk menggerakkan partikel CombiMag di sepanjang permukaan trakea.Dengan demikian, kami menyimpulkan bahwa penelitian LV MF in vivo harus menggunakan medan magnet statis untuk secara fisik menargetkan area spesifik pada pohon saluran napas.
Setelah partikel masuk ke dalam tubuh, mereka sulit diidentifikasi dalam konteks jaringan tubuh yang bergerak kompleks, namun kemampuan pendeteksiannya telah ditingkatkan dengan menggerakkan magnet secara horizontal di atas trakea untuk “menggoyangkan” string MP.Meskipun pencitraan secara real-time dapat dilakukan, namun lebih mudah untuk membedakan pergerakan partikel setelah hewan tersebut dibunuh secara manusiawi.Konsentrasi MP biasanya tertinggi di lokasi ini ketika magnet diposisikan di atas area pencitraan, meskipun beberapa partikel biasanya ditemukan jauh di bawah trakea.Berbeda dengan penelitian in vitro, partikel tidak dapat terseret ke bawah trakea dengan pergerakan magnet.Temuan ini konsisten dengan bagaimana lendir yang menutupi permukaan trakea biasanya memproses partikel yang terhirup, menjebaknya di dalam lendir dan kemudian membersihkannya melalui mekanisme pembersihan muko-siliar.
Kami berhipotesis bahwa penggunaan magnet di atas dan di bawah trakea untuk daya tarik (Gambar 3b) dapat menghasilkan medan magnet yang lebih seragam, dibandingkan medan magnet yang sangat terkonsentrasi pada satu titik, yang berpotensi menghasilkan distribusi partikel yang lebih seragam..Namun, studi pendahuluan kami tidak menemukan bukti jelas yang mendukung hipotesis ini.Demikian pula, mengatur sepasang magnet untuk menolak (Gbr. 3c) tidak menghasilkan lebih banyak partikel yang mengendap di area gambar.Kedua temuan ini menunjukkan bahwa pengaturan magnet ganda tidak secara signifikan meningkatkan kontrol lokal terhadap penunjuk MP, dan bahwa gaya magnet kuat yang dihasilkan sulit untuk disesuaikan, sehingga membuat pendekatan ini kurang praktis.Demikian pula, mengarahkan magnet ke atas dan melintasi trakea (Gambar 3d) juga tidak meningkatkan jumlah partikel yang tersisa di area gambar.Beberapa konfigurasi alternatif ini mungkin tidak berhasil karena mengakibatkan penurunan kekuatan medan magnet di zona pengendapan.Dengan demikian, konfigurasi magnet tunggal pada 30 derajat (Gbr. 3a) dianggap sebagai metode pengujian in vivo yang paling sederhana dan efisien.
Studi LV-MP menunjukkan bahwa ketika vektor LV digabungkan dengan CombiMag dan diberikan setelah diganggu secara fisik dengan adanya medan magnet, tingkat transduksi meningkat secara signifikan di trakea dibandingkan dengan kontrol.Berdasarkan studi pencitraan sinkrotron dan hasil LacZ, medan magnet tampaknya mampu menjaga LV tetap berada di trakea dan mengurangi jumlah partikel vektor yang segera menembus jauh ke dalam paru-paru.Peningkatan penargetan tersebut dapat menghasilkan efisiensi yang lebih tinggi sekaligus mengurangi titer yang diberikan, transduksi yang tidak ditargetkan, efek samping inflamasi dan kekebalan tubuh, serta biaya transfer gen.Yang penting, menurut produsennya, CombiMag dapat digunakan dalam kombinasi dengan metode transfer gen lainnya, termasuk vektor virus lainnya (seperti AAV) dan asam nukleat.