Giardia duodenum merupakan organisme parasit penyebab giardiasis, yaitu infeksi usus yang sering terjadi pada anak kecil dengan gejala klinis diare.Kami sebelumnya telah melaporkan bahwa G. duodenalis ekstraseluler memicu aktivasi nukleotida pengikat reseptor 3 seperti oligomerisasi intraseluler (NLRP3) dan mengatur respons inflamasi inang melalui sekresi vesikel ekstraseluler (EV).Namun, pola molekuler yang tepat dari duodenococcal EV (GEV) terkait patogen yang terlibat dalam proses ini dan peran inflamasiom NLRP3 pada giardiasis masih harus dijelaskan.
Plasmid ekspresi eukariotik rekombinan pcDNA3.1(+)-alpha-2 dan alpha-7.3 giardin dalam GEV dibuat, ditransfusikan ke makrofag peritoneum primer tikus, dan dideteksi dengan mengukur molekul target peradangan caspase-1.Tingkat ekspresi p20 disaring..G. duodenalis alpha-2 dan alpha-7.3 giardine awalnya diidentifikasi dengan mengukur inflamasiom NLRP3 (NLRP3, pro-interleukin-1 beta [IL-1β], pro-caspase-1 dan caspase-1 p20), sekresi IL.tingkat 1β, tingkat oligomerisasi protein berbintik apoptosis (ASC), dan lokalisasi imunofluoresen NLRP3 dan ASC.Peran inflamasiom NLRP3 dalam patogenisitas G. duodenalis kemudian dinilai menggunakan tikus yang aktivasi NLRP3 diblokir (tikus yang diblokir NLRP3) dan perubahan patologis pada berat badan, beban parasit duodenum, dan jaringan duodenum dipantau.Selain itu, kami menyelidiki apakah hiardine alpha-2 dan alpha-7.3 menginduksi sekresi IL-1β in vivo melalui inflammasome NLRP3 dan menentukan peran molekul-molekul ini dalam patogenisitas G. duodenalis pada tikus.
Giardin alfa-2 dan alfa-7.3 menginduksi aktivasi inflamasiom NLRP3 secara in vitro.Hal ini menyebabkan aktivasi p20 caspase-1, peningkatan tingkat ekspresi protein NLRP3, pro-IL-1β, dan pro-caspase-1, peningkatan signifikan dalam sekresi IL-1β, pembentukan bintik ASA di kulit. sitoplasma, dan induksi oligomerisasi ASA.Peradangan NLRP3 Hilangnya penis memperburuk patogenisitas G. duodenalis pada tikus.Tikus yang diobati dengan kista dengan gavage dari tikus yang diblokir NLRP3 menunjukkan peningkatan jumlah trofozoit dan kerusakan parah pada vili duodenum, ditandai dengan kriptus nekrotik yang menyusut dan bercabang.Eksperimen in vivo menunjukkan bahwa giardines alpha-2 dan alpha-7.3 dapat menginduksi sekresi IL-1β melalui inflammasome NLRP3, dan imunisasi dengan giardines alpha-2 dan alpha-7.3 mengurangi patogenisitas G. duodenalis pada tikus.
Secara keseluruhan, hasil penelitian ini menunjukkan bahwa giardia alpha-2 dan alpha-7.3 menyebabkan peningkatan regulasi peradangan inang NLRP3 dan mengurangi infektivitas G. duodenalis pada tikus, yang merupakan target yang menjanjikan untuk mencegah giardiasis.
Giardia duodenum merupakan parasit protozoa ekstraseluler yang hidup di usus kecil dan menyebabkan 280 juta kasus giardiasis disertai diare setiap tahunnya, terutama pada anak kecil di negara berkembang [1].Orang terinfeksi melalui air minum atau makanan yang terkontaminasi kista M. duodenum, yang kemudian masuk ke lambung dan dikeluarkan melalui cairan lambung.Trofozoit Giardia duodenum menempel pada epitel duodenum, menyebabkan mual, muntah, diare, sakit perut, dan penurunan berat badan.Individu dengan imunodefisiensi dan fibrosis kistik rentan terhadap infeksi.Infeksi juga dapat terjadi melalui seks oral dan anal [2].Obat-obatan seperti metronidazol, tinidazol, dan nitazoxanide adalah pilihan pengobatan yang lebih disukai untuk infeksi duodenum [3].Namun obat kemoterapi ini menimbulkan efek samping yang merugikan seperti mual, karsinogenesis, dan genotoksisitas [4].Oleh karena itu, strategi yang lebih efektif perlu dikembangkan untuk mencegah infeksi G. duodenalis.
Inflammasom adalah kelas kompleks protein sitosol yang merupakan bagian dari respon imun bawaan, membantu bertahan melawan invasi patogen dan memediasi respon inflamasi [5].Di antara inflammasom ini, oligomerisasi pengikat nukleotida (NOD) reseptor 3 (NLRP3) oligomerisasi pengikat nukleotida (NLRP3) inflammasom seperti pengikatan nukleotida telah dipelajari secara ekstensif karena dapat dideteksi oleh berbagai pola molekuler terkait patogen/kerusakan (PAMP/ DAMP), mengenali, mengaktifkan sistem kekebalan bawaan.dan mengatur homeostasis usus pada banyak penyakit inflamasi [6,7,8].Ini terdiri dari reseptor pengenalan pola (PRR) NLRP3, adaptor protein bintik apoptosis (ASC), dan efektor procaspase-1 atau procaspase-11.Peradangan NLRP3 bertindak sebagai inang melawan invasi patogen, seperti yang diamati dalam studi Neospora caninum [9], Paracoccidioides brasiliensis [10], dan Leishmania.[11], tetapi juga telah dilaporkan bahwa aktivasi inflamasiom NLRP3 membatasi respon imun protektif dan memperburuk perkembangan penyakit, misalnya pada cacing [12].Berdasarkan temuan kami sebelumnya, kami melaporkan bahwa G. duodenalis ekstraseluler memicu aktivasi inflamasi NLRP3 intraseluler dan memodulasi respons inflamasi inang dengan mensekresi vesikel ekstraseluler (EVs) (13).Namun, peran inflamasiom NLRP3 pada infeksi G. duodenalis in vivo masih harus ditentukan.
Giardin awalnya digambarkan sebagai komponen struktural sitoskeleton G. duodenalis dan memainkan peran penting dalam motilitas trofozoit dan perlekatan sel epitel di usus kecil.Untuk lebih beradaptasi dengan lingkungan dan meningkatkan patogenisitasnya, trofozoit G. duodenalis mengembangkan struktur sitoskeletal unik yang terdiri dari 8 flagela, 1 tubuh tengah, dan 1 cakram ventral [14].Trofozoit Giardia duodenum menggunakan sitoskeletonnya untuk menembus usus halus bagian atas, terutama duodenum, dan menempel pada enterosit.Mereka terus-menerus bermigrasi dan menempel pada sel epitel menggunakan metabolisme sel.Oleh karena itu, ada hubungan erat antara sitoskeleton dan virulensinya.Giardine khusus untuk Giardia duodenum adalah komponen struktur sitoskeleton [15] dan dibagi menjadi empat kelas: α-, β-, γ-, dan δ-giardines.Ada 21 anggota keluarga α-giardin, yang semuanya memiliki kemampuan bergantung pada kalsium untuk mengikat fosfolipid [16].Mereka juga menghubungkan sitoskeleton ke membran sel.Pada individu dengan diare yang disebabkan oleh G. duodenalis, α-giardin sangat diekspresikan dan imunoreaktif selama infeksi [17].Vaksin heterolog berdasarkan Giardia alfa-1 melindungi terhadap giardiasis pada tikus dan merupakan kandidat antigen potensial untuk pengembangan vaksin [18].Giardin alfa-8, terlokalisasi di membran plasma dan flagela, tetapi tidak di cakram ventral, meningkatkan motilitas dan laju pertumbuhan trofozoit di G. duodenalis [19].Giardin alfa-14 menempel pada struktur mikrotubulus pada flagela dan mempengaruhi kelangsungan hidup G. duodenalis [20].Giardine alfa-11 hadir dalam jumlah besar sepanjang siklus hidup, dan ekspresi berlebih dari giardin alfa-11 merusak G. duodenalis itu sendiri [21].Namun, tidak jelas apakah alpha-2 giardine dan alpha-7.3 giardine melindungi terhadap infeksi G. duodenalis dan mekanisme yang mendasarinya.
Dalam penelitian ini, plasmid ekspresi eukariotik rekombinan pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine dan pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardine ditransfusikan ke makrofag peritoneum primer tikus untuk mengaktifkan host NLRP3.Target yang menimbulkan peradangan kemudian disaring.Kami juga menilai peran inflammasome NLRP3 dalam patogenisitas G. duodenalis, menyelidiki apakah giardine alfa-2 dan alfa-7,3 menginduksi aktivasi inflammasome NLRP3 in vivo, dan menentukan bahwa kedua peran giardine ini dalam patogenisitas penyakit G.duodenal.Tujuan bersama kami adalah mengembangkan target yang menjanjikan untuk pencegahan infeksi G. duodenalis.
Tikus betina tipe liar (WT) C57BL / 6 berusia 5-8 minggu dibeli dari Pusat Hewan Eksperimental Liaoning Changsheng (Liaoning, Cina).Tikus memiliki akses bebas terhadap air, menerima makanan yang disterilkan, dan dipelihara dalam siklus terang/gelap 12/12 jam.Sebelum terinfeksi, tikus menerima antibiotik ad libitum dalam air minum yang dilengkapi dengan ampisilin (1 mg/mL), vankomisin (1 mg/mL), dan neomycin (1,4 mg/mL) (semuanya dibeli dari Shanghai, Tiongkok, organisme buatan) [ 22 ].].Mencit yang kehilangan kemampuan makan dan minum selama > 24 jam dan kehilangan ≥ 20% berat badannya di-eutanasia secara manusiawi dengan cara dislokasi serviks.
Trofozoit WB G. duodenalis (American Type Culture Collection, Manassas, USA) ditambah dengan 12,5% serum janin sapi (FBS; Every Green, Zhejiang, China) dan 0,1% empedu sapi (Sigma-Aldrich, St. Missouri, USA) ).USA) dalam kondisi mikroaerobik.Trofozoit konfluen dikumpulkan di atas es dan dilewatkan dengan perbandingan 1:4 untuk reproduksi lebih lanjut.
Kista Giardia duodenum diinduksi seperti dijelaskan sebelumnya [23], trofozoit dipanen dalam fase logaritmik dan kemudian diencerkan dengan media penginduksi enkapsulasi, pH 7,1 (dimodifikasi TYI-S-33) hingga konsentrasi akhir 1 × 106 trofozoit/mL.konsentrasi empedu 0,05% sedang).Trofozoit dikultur dalam kondisi anaerobik pada suhu 37°C hingga fase pertumbuhan logaritmik.Ubah media menjadi media penginduksi kista (pH 7,8; ​​media TYI-S-33 yang dimodifikasi dengan konsentrasi empedu 1%) dan kultur G. duodenalis pada suhu 37°C selama 48–96 jam, selama itu pembentukan kista diamati di bawah mikroskop.Setelah sebagian besar trofozoit diinduksi untuk membentuk kista, campuran kultur dipanen dan diresuspensi dalam air deionisasi steril untuk melisiskan sisa trofozoit.Kista dihitung dan disimpan pada suhu 4°C untuk analisis selanjutnya melalui tabung lambung pada tikus.
Vesikel ekstraseluler Giardia (GEVs) diperkaya seperti dijelaskan sebelumnya (13).Trofozoit dalam fase pertumbuhan logaritmik diresuspensi dalam medium TYI-S-33 yang dimodifikasi yang disiapkan dengan FBS (Biological Industries, Beit-Haemek, Israel) yang mengalami deplesi eksosom hingga konsentrasi akhir 1 × 106 parasit/mL dan diinkubasi selama 12 jam.diisolasi dari supernatan kultur dengan sentrifugasi pada 2000 g selama 10 menit, 10.000 g selama 45 menit, dan 100.000 g selama 60 menit.Endapan dilarutkan dalam larutan salin buffer fosfat (PBS), diukur dengan menggunakan alat pengujian protein BCA (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) dan disimpan pada suhu -80°C atau digunakan secara langsung untuk analisis lebih lanjut.
Makrofag peritoneum tikus primer dibuat seperti dijelaskan sebelumnya [24].Secara singkat, tikus (berusia 6-8 minggu) disuntik (secara intraperitoneal [ip]) dengan 2,5 ml media tioglikol cair Difco 2,98% (BD, Franklin Lakes, NJ, USA) dan diberi makan 3-4 selera.Suspensi makrofag dikumpulkan dari rongga perut tikus setelah eutanasia dan disentrifugasi 3 kali pada 1000 g selama 10 menit.Sel yang dipanen dideteksi dengan flow cytometry menggunakan penanda CD11b hingga kemurnian sel >98%, kemudian ditambahkan ke dalam pelat kultur sel 6 sumur (4,5 x 106 sel/sumur) dan diinkubasi dengan 10% FBS (Bioindustri) pada suhu 37°C.dan 5% CO2.
RNA diekstraksi dari 1 × 107 trofozoit dalam 1 ml reagen TRIzol (Vazyme, Nanjing, China), DNA genom diekstraksi dari total RNA G. duodenalis menggunakan MonScript dsDNase (Monad, Wuhan, China) dan DNA komplementer (cDNA) disintesis menggunakan MonScript RTIIII Super Mix (Monad) sesuai petunjuk pabriknya.
Informasi sekuens CDS untuk gen target G. duodenalis diperoleh dari NCBI GenBank.Gunakan Primer 5.0 untuk merancang primer kloning mulus yang spesifik untuk setiap gen target.Primer maju (5′-3′) terdiri dari tiga bagian: urutan yang tumpang tindih dengan vektor linear pcDNA3.1(+) EcoRV (TGGTGGAATTCTGCAGAT) dan kodon awal ATG dan GNN (jika basis pertama bukan G).Hal ini dilakukan untuk meningkatkan efisiensi ekspresi.Selain itu, setidaknya 16 bp basa gabungan (kandungan GC 40–60%/Tm sekitar 55 °C).Primer terbalik (5′-3′) terdiri dari dua bagian, urutan yang tumpang tindih dengan vektor pcDNA3.1(+) linierisasi EcoRV (GCCGCCACTGTGCTGGAT) dan basis gabungan setidaknya 16 bp.(tidak termasuk dua perhentian terakhir).basa) kodon seperti AA atau GA untuk memungkinkan plasmid rekombinan mengekspresikan protein berlabelnya).Urutan primer tercantum pada Tabel 1 dan disintesis oleh Kangmet Biotechnology Co., Ltd. (Changchun, Cina).
Target diamplifikasi menggunakan Pfu DNA polimerase (Tiangen, Beijing, China) atau Ex-taq (Takara Biomedical Technology [Beijing] Co., Ltd., Beijing, China) menggunakan cDNA G. duodenalis yang telah disiapkan sebagai templat.Vektor ekspresi eukariotik plasmid pcDNA3.1(+) dilinearisasi dengan enzim restriksi EcoRV dan didefosforilasi menggunakan Fast AP (Thermo Fisher Scientific).Fragmen pcDNA3.1(+) yang dilinearisasi dan fragmen gen target yang diamplifikasi dimurnikan menggunakan kit pemurnian gel DNA (Tiangen) dan diukur menggunakan Nanodrop ND-2000 (Thermo Fisher Scientific).Fragmen pcDNA3.1(+) dan setiap fragmen gen target digabungkan kembali menggunakan campuran kloning perakitan tunggal MonClone (Monad Biotech Co., Ltd., Suzhou, Cina) dan dikonfirmasi dengan pengurutan DNA menggunakan Comate Bioscience Company Limited (Changchun, Cina)..
Plasmid bebas endotoksin pcDNA3.1(+)-alpha-2 dan pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 dihasilkan menggunakan Kit Mini Plasmid bebas Endotoksin SanPrep (Sangon Biotech).Konsentrasi dipertahankan di atas 500 ng/µl untuk memastikan bahwa EDTA dalam buffer elusi tidak mengganggu uji transfeksi.Makrofag peritoneum tikus primer dikultur dalam 6-well plate dengan medium lengkap RPMI 1640 (Biological Industries) selama 12 jam, kemudian sel dicuci 3 kali dalam PBS hangat untuk menghilangkan penisilin dan streptomisin, dan kemudian dalam medium yang dilengkapi dengan medium lengkap.Plasmid bebas endotoksin pcDNA3.1(+)-alpha-2 dan pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 (2,5 μg) diencerkan dalam 125 μl media serum tereduksi Opti-MEM (Gibco, Thermo Fisher Scientific)..Kemudian 5 μl reagen transfeksi Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific) diencerkan dalam 125 μl media Opti-MEM serum rendah.Siapkan kompleks liposom-DNA dengan mencampurkan plasmid bebas endotoksin yang diencerkan dengan Lipofectamine 2000 dan mendiamkan campuran pada suhu kamar selama 5 menit.Pindahkan kompleks secara terpisah ke sel di setiap sumur dan aduk perlahan.Setelah 4 jam, media kultur sel diganti dengan 2 ml media lengkap RPMI 1640 dan kultur dilanjutkan selama 24 jam.Media kultur sel segar ditambahkan ke dalam sel dan diinkubasi untuk berbagai titik waktu tergantung pada desain pengujian.
Sampel protein dari supernatan dan lisat sel dibuat seperti dijelaskan sebelumnya [25].Parameter transfer membran untuk pro-IL-1β, pro-caspase-1, caspase-1 p20, NLRP3, β-actin, dan His-tag adalah 200 mA/90 menit.Untuk interleukin 1β (IL-1β; R&D Systems, Minneapolis, Minnesota, USA), caspase-1 (p20) (Adipogen, Swiss) dan NLRP3 (Adipogen SA, Epalinges, Swiss) dan penargetan 1:5000 tag-Nya ( Amylet Scientific, Wuhan, Cina) dan β-aktin (Proteintech, Wuhan, Cina).
Tautan silang dengan disuccinimide suberate (DSS) dilakukan seperti yang dijelaskan sebelumnya [26].Sel dicuci 3 kali dengan PBS dingin dan dilisiskan seluruhnya dengan jarum pengukur 27 dalam 50 μl buffer reaksi ASC (pH 8,0) yang mengandung 25 mM Na2PO4, 187,5 mM NaCl, 25 mM HEPES dan 125 mM NaHCO3.Campuran disentrifugasi pada 5000 g selama 3 menit dan pelet dijahit dengan 10 μl DSS (25 mM dalam DMSO) dan 40 μl buffer reaksi ASC selama 30 menit pada suhu 37°C.Setelah sentrifugasi pada 5000 g selama 10 menit, pelet dilarutkan dalam larutan 40 μl buffer reaksi ASC dan 10 μl buffer pemuatan protein 6x (TransGen, Beijing, China), dan kemudian larutan dipadamkan pada suhu kamar selama 15 menit., Lalu rebus 10 menit.Sampel protein kemudian dilakukan Western blotting menggunakan antibodi anti-ASC primer (Wanleibio, Shenyang, China) dengan rasio pengenceran 1:500.
Mengikuti prosedur yang dijelaskan sebelumnya [13], supernatan kultur sel dipanen dan sekresi sitokin pro-inflamasi IL-1β ditentukan menggunakan kit ELISA IL-1 Beta tikus (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific).Ubah nilai OD450nm menjadi konsentrasi protein menggunakan kurva standar IL-1β.
Sel yang dilapisi pada kaca penutup dicuci dengan lembut 3 kali dalam PBS hangat, difiksasi dalam fiksatif sel jaringan (Biosharp, Beijing, Cina) selama 10 menit pada suhu kamar (RT), dalam 0,1% Triton X-Permeabilize pada 100 (diencerkan dalam PBS; Biosharp ) selama 20 menit pada suhu kamar dan blok dalam 5% bovine serum albumin (dalam PBS) selama 2 jam pada suhu kamar.Sel kemudian diinkubasi semalaman pada suhu 4°C dengan antibodi primer terhadap ASC (pengenceran 1:100) atau NLRP3 (pengenceran 1:100), dan Cy3 berlabel IgG anti-kelinci kambing (H+L) (1:400; EarthOx , San Francisco, CA, USA) atau IgG anti-tikus kambing terkonjugasi FITC (1:400; Earthox) semalaman pada suhu 37°C dalam gelap selama 1 jam.Inti diwarnai dengan Hoechst 33258 (10 μg/ml; UE, Suzhou, China) selama 5 menit dan diamati di bawah mikroskop fluoresensi (Olympus Corporation, Tokyo, Jepang).
Tikus dibagi menjadi empat kelompok (n = 7 di setiap kelompok): (i) kelompok kontrol negatif yang diobati dengan PBS (hanya PBS; gavage 100 μl/PBS tikus diikuti dengan injeksi intraperitoneal harian 100 μl/PBS tikus 3 jam kemudian)., terus menerus selama 7 hari);(ii) kelompok kontrol negatif diobati dengan inhibitor MCC950 [27] (100 μl/tikus melalui PBS gavage, 3 jam kemudian, 10 mg/kg berat badan [BB] MCC950 [dalam PBS] diberikan secara intraperitoneal setiap hari, durasi 7 hari);(iii) Kelompok infeksi kista G. duodenalis (1,5 x 106 kista/tikus secara gavage, 3 jam kemudian, 100 μl/tikus PBS diberikan secara intraperitoneal setiap hari selama 7 hari);(iv) Kelompok infeksi gabungan kista G. duodenalis Kelompok pengobatan inhibitor MCC950 (1,5×106 kista/tikus melalui gavage, 10mg/kg berat badan MCC950 intraperitoneal setiap hari selama 7 hari dalam 3 jam).Berat badan masing-masing tikus dipantau setiap hari dan semua tikus di-eutanasia pada hari ke 7.Duodenum yang dipanen (panjang 3 cm) dipotong kecil-kecil dalam 1 ml PBS, kista dihancurkan semalaman dalam PBS pada suhu 4°C, dan trofozoit G. duodenalis.Duodenum segar (panjang 1 cm) diisolasi untuk pewarnaan hematoksilin dan eosin (H&E).
Tikus dibagi menjadi dua kelompok: (i) kelompok kontrol MOCK dan (ii) kelompok penghambat MCC950.Ada lima perlakuan di setiap kelompok (n = 7/kelompok perlakuan): (i) kelompok kontrol negatif pengobatan PBS (hanya PBS; PBS 100 μl/tikus, injeksi intramuskular (IM) (tibialis anterior) [28, 29] ;( ii) pcDNA3.1(+) kelompok kontrol negatif plasmid (100 µg/DNA tikus, melalui injeksi intramuskular); (iii) kelompok kontrol positif infeksi kista G. duodenalis (1,5 x 106 kista/tikus, melalui gavage) (iv) a kelompok yang diobati dengan plasmid pcDNA3.1(+)-alpha-2 (100 μg/DNA tikus, melalui injeksi intramuskular), dan (v) kelompok yang diobati dengan plasmid pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 (100 μg/tikus DNA, setelah 12 jam perjalanan, tikus dalam kelompok penghambat MCC950 menerima suntikan MCC950 intraperitoneal setiap hari (10 mg/kg berat badan) selama 7 hari, sedangkan tikus dalam kelompok MOCK menerima pengobatan PBS dengan volume yang sama. dikumpulkan dari bola mata tikus dan dibiarkan semalaman pada suhu 4 ° C. Sampel serum diisolasi menggunakan uji imunosorben terkait-enzim (ELISA) untuk dan pengukuran kadar IL-1β.
Tiga puluh lima tikus dibagi menjadi lima kelompok (n=7/kelompok).Kelompok 1 adalah kelompok kontrol negatif yang diobati dengan PBS: tikus menerima 100 μl PBS secara intramuskular dan 3 hari kemudian melalui gavage.Kelompok 2 merupakan kelompok kontrol positif yang terinfeksi kista G. duodenalis: mencit disuntik PBS sebanyak 100 μl, dan 3 hari kemudian 1,5 x 106 kista/mencit disuntik secara intragastrik.Kelompok ketiga – imunisasi plasmid dengan pcDNA3.1(+) dalam kombinasi dengan kelompok kontrol untuk infeksi kista duodenum: tikus menerima 100 μg DNA plasmid pcDNA3.1(+)(im) secara oral, 1,5×106 kista/tikus 3 untuk beberapa hari.Kelompok 4 dan 5 adalah plasmid giardine pcDNA3.1(+)-alpha-2 rekombinan atau plasmid giardine pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 yang dikombinasikan dengan infeksi kista G. duodenalis.Kelompok eksperimen: tikus menerima 100 μg pcDNA3.1(+)-giardine plasmid DNA (im), kemudian 3 hari kemudian, 1,5 × 106 kista/tikus diinjeksi melalui gavage.Berat badan masing-masing tikus dipantau setelah kista G. duodenalis dimasukkan melalui tabung.Duodenum segar dikumpulkan untuk pengukuran beban parasit dan analisis pewarnaan HE.
Perubahan histopatologis dianalisis berdasarkan prosedur yang dipublikasikan sebelumnya [30].Duodenum segar difiksasi dengan fiksatif sel jaringan, ditanamkan dalam parafin, dipotong menjadi beberapa bagian berukuran 4 μm, diwarnai dengan H&E dan dianalisis di bawah mikroskop cahaya.Perubahan patologis yang representatif pada tujuh bagian jaringan dari tujuh tikus independen dievaluasi oleh ahli patologi yang tidak mengetahui pengobatan dan ditangkap pada pembesaran 200x.Panjang vili dan kedalaman ruang bawah tanah diukur sesuai dengan metode yang telah dijelaskan sebelumnya.
Hasil in vitro dan in vivo diperoleh rangkap tiga.Grafik dihasilkan menggunakan GraphPad Prism 7.00 (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USA).Perbedaan antara dua kelompok dianalisis dengan uji-t, sedangkan perbedaan antara ≥3 kelompok dianalisis dengan analisis varians satu arah (ANOVA) menggunakan perangkat lunak SPSS (versi 22.0; SPSS IBM Corp., Armonk, NY, USA).Data dianalisis homogenitas variansnya dengan menggunakan uji Levene yang dilanjutkan dengan uji post hoc Bonferroni (B).Signifikansi dinyatakan sebagai P<0,05, P<0,01, dan P<0,001 (tidak signifikan [ns]) (P>0,05).
Analisis kami sebelumnya mengenai proteomik GEV di Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) menunjukkan bahwa banyak target mungkin terlibat dalam aktivasi jalur sinyal inflamasi [13].Kami memilih dua target yang menjanjikan, giardin alfa-2 dan alfa-7.3, memperkuat molekul-molekul ini dan menggunakannya untuk membuat vektor ekspresi eukariotik pcDNA3.1(+).Setelah diurutkan, plasmid ekspresi giardine pcDNA3.1(+)-alpha-2 dan alpha-7.3 rekombinan ditransfusikan ke makrofag peritoneum tikus primer, dan protein khas peradangan caspase-1 p20 (sebuah fragmen dari caspase-1 yang diaktifkan) diidentifikasi. sebagai menjelaskan molekul kunci yang dapat memicu peradangan.Hasil penelitian menunjukkan bahwa giardine alpha-2 dan alpha-7.3 dapat menginduksi ekspresi p20 caspase-1 yang mirip dengan GEV.Tidak ada efek pada aktivasi caspase-1 yang ditemukan pada kontrol negatif yang tidak diobati (hanya PBS) dan kontrol plasmid pcDNA3.1(+) (Gambar 1).
Pengukuran aktivasi p20 caspase-1 oleh pcDNA3.1(+)-alpha-2 dan alpha-7.3 giardins.Plasmid ekspresi eukariotik rekombinan pcDNA3.1(+)-alpha-2 dan alpha-7.3 giardine (di atas setiap jalur) ditransfusikan ke makrofag peritoneum tikus primer dan supernatan kultur dipanen 24 jam kemudian.Western blotting digunakan untuk mengukur tingkat ekspresi protein inflamasi caspase-1 p20 yang khas.Kelompok perlakuan hanya PBS (jalur C) dan kelompok monoterapi pcDNA3.1(+) (jalur pcDNA3.1) digunakan sebagai kontrol negatif, dan kelompok perlakuan GEV digunakan sebagai kontrol positif.Ekspresi protein rekombinan dikonfirmasi dengan mendeteksi tag histidin di setiap protein, dan pita protein yang diharapkan adalah alpha-2 giardine (38,2 kDa) dan alpha-7,3 giardine (37,2 kDa).GEV, vesikel ekstraseluler Giardia duodenum, pcDNA3.1(+), vektor linierisasi EcoRV, SUP, supernatan
Untuk menentukan apakah alpha-2 giardine dan alpha-7.3 giardine menginduksi ekspresi p20 caspase-1 dan berperan dalam mengaktifkan respon inflamasi host NLRP3, pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine dan pcDNA3.1(+)-alpha -7,3 giardin ditransfusikan ke makrofag peritoneum tikus primer dengan DNA plasmid rekombinan, dan tingkat ekspresi, lokalisasi, dan oligomerisasi protein inflamasi utama NLRP3 ditentukan.Dalam percobaan ini, GEV digunakan sebagai kelompok kontrol positif, dan kelompok tanpa perlakuan (PBS saja) atau kelompok perlakuan transfeksi pcDNA3.1(+) adalah kelompok negatif.Hasil penelitian menunjukkan bahwa, seperti pada kelompok GEV, DNA plasmid rekombinan giardin pcDNA3.1(+)-alpha-2 dan giardin pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 menghasilkan peningkatan regulasi NLRP3, pro-IL-1β dan aktivasi procaspase-1 dan caspase-1 (Gbr. 2a).Selain itu, kedua giardine menginduksi sekresi IL-1β yang signifikan (pcDNA3.1: ANOVA, F(4, 10) = 1.625, P = 0.1000; alpha-2 giardine: ANOVA, F(4, 10) = 1.625, P = 0.0007 ).;alpha-7.3 giardine: ANOVA, F(4, 10) = 1,625, P<0,0001;GEV: ANOVA, F(4, 10) = 1,625, P = 0,0047) (Gambar 2b).Sebagian besar protein ASC bersifat monomer pada kelompok tanpa pengobatan atau pada kelompok perlakuan yang ditransfeksi dengan plasmid pcDNA3.1(+), berbeda dengan pcDNA3.1(+)-alpha-2 atau pcDNA3.1(+)-alpha- 7.3 giardin.Oligomerisasi ASC terjadi pada DNA plasmid rekombinan kelompok atau kelompok kontrol positif GEV, menunjukkan bentuk oligomer (Gambar 2c).Data awal ini menunjukkan bahwa giardine alfa-2 dan giardin alfa-7,3 dapat menginduksi aktivasi peradangan NLRP3.Studi imunofluoresen selanjutnya dari lokalisasi ASC dan NLRP3 menunjukkan bahwa pada kelompok kontrol negatif, protein ASC tersebar di seluruh sitoplasma dan muncul sebagai sinyal titik ketika pcDNA3.1(+)-alpha-2 distimulasi dengan giardine atau pcDNA3.Kelompok giardine 1(+)-alpha-7,3 atau kelompok kontrol positif GEV (Gambar 2d).Pada kelompok kontrol negatif dan kelompok pcDNA 3.1 yang diberi plasmid, sinyal protein NLRP3 tidak terdeteksi, sedangkan titik sinyal fluoresen sebagai respons terhadap pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine atau pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 terdeteksi..giardine ditemukan di sitoplasma atau setelah stimulasi HEV (Gbr. 2e).Data ini lebih lanjut menunjukkan bahwa G. duodenalis giardin alpha-2 dan giardin alpha-7.3 mengaktifkan inflamasiom NLRP3 pada makrofag peritoneum primer tikus.
pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardin dan pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardin mengaktifkan inflamasi NLRP3 pada makrofag peritoneum tikus.Transfeksi plasmid ekspresi eukariotik rekombinan pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardin dan pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardin ke dalam makrofag dan sel peritoneum murine primer, atau panen supernatan dalam waktu 24 jam untuk analisis ekspresi, oligomerisasi , sekresi.dan lokalisasi protein inflamasi utama.Kelompok PBS saja (C) dan kelompok perlakuan tunggal pcDNA3.1(+) digunakan sebagai kontrol negatif, dan kelompok perlakuan GEV digunakan sebagai kelompok positif.a Protein inflamasi utama NLRP3, termasuk NLRP3, pro-IL-1β, pro-caspase-1, dan p20 caspase-1, dideteksi dengan Western blotting.b Tingkat sekresi IL-1β dalam supernatan ditentukan dengan menggunakan enzim-linked immunosorbent assay (ELISA).Perbedaan antara kelompok kontrol dan eksperimen dianalisis dengan analisis varian satu arah (ANOVA) menggunakan software SPSS versi 22.0.Tanda bintang menunjukkan perbedaan yang signifikan antar kelompok **P<0,01 dan ***P<0,001.c Tingkat oligomerisasi ASC dalam pelet ditentukan dengan analisis ikatan silang DSS, sedangkan tingkat ASC dalam sel lisat digunakan sebagai kontrol pemuatan.d Visualisasi lokalisasi ISC menggunakan imunofluoresensi.e Imunofluoresensi digunakan untuk memvisualisasikan lokalisasi NLRP3.ASC, protein mirip bintik apoptosis;IL, interleukin;NLRP3, reseptor mirip oligomerisasi pengikat nukleotida 3;ns, tidak signifikan (P > 0,05)
Baik G. duodenalis dan GEV yang dikeluarkannya mengaktifkan inflamasiom NLRP3 dan mengatur respon inflamasi inang secara in vitro.Dengan demikian, peran inflamasiom NLRP3 dalam patogenisitas G. duodenalis masih belum jelas.Untuk menyelidiki masalah ini, kami merancang percobaan antara tikus yang terinfeksi kista G. duodenalis dan tikus yang terinfeksi kista G. duodenalis + pengobatan inhibitor MCC950 dan membandingkan ekspresi inflamasi NLRP3 ketika terinfeksi kista G. duodenalis.Skema percobaan yang rinci ditunjukkan pada Gambar 3a.Perubahan berat badan tikus pada kelompok perlakuan berbeda dipantau selama 7 hari setelah infeksi kista, dan hasilnya ditunjukkan pada Gambar 3b.Dibandingkan dengan kelompok yang diberi PBS murni, hasil penelitian menunjukkan bahwa (i) berat badan mencit yang terinfeksi kista G. duodenalis mengalami penurunan dari hari ke 3 hingga hari ke 7 setelah infeksi;(ii) pengobatan dengan inhibitor MCC950 tidak memberikan pengaruh yang signifikan terhadap berat badan tikus..Dibandingkan dengan kelompok infeksi tunggal, BB kelompok infeksi duodenum yang diobati dengan MCC950 mengalami penurunan dengan derajat yang bervariasi (Hari 1: ANOVA, F(3, 24) = 1,885, P = 0,0148; Hari 2: ANOVA, F( 3, 24 ) = 0,4602, P<0,0001; Hari ke-3: ANOVA, F(3, 24) = 0,8360, P = 0,0010; Hari ke-4: ANOVA, F(3, 24) = 1,683, P = 0,0052; (3, 24)=0,6497, P=0,0645; Hari 6: ANOVA, F(3, 24)=5,457, P=0,0175; Hari 7: ANOVA, F(3, 24) = 2,893, P = 0,0202).Data ini menunjukkan bahwa inflamasiom NLRP3 melindungi tikus dari penurunan berat badan yang signifikan pada tahap awal (2-4 hari) infeksi duodenum.Kami kemudian bertujuan untuk mendeteksi trofozoit G. duodenalis dalam cairan lavage duodenum dan hasilnya ditunjukkan pada Gambar 3c.Dibandingkan dengan kelompok infeksi kista G. duodenalis, jumlah trofozoit di duodenum meningkat secara signifikan setelah pemblokiran inflamasiom NLRP3 (t(12) = 2,902, P = 0,0133).Jaringan duodenum yang diwarnai dengan HE menunjukkan, dibandingkan dengan kontrol negatif yang diobati dengan PBS dan MCC950 saja: (i) Infeksi kista G. duodenalis mengakibatkan kerusakan pada vili duodenum (ANOVA, F(3, 24)=0.4903, P= 0.0488 ) dan atrofi ruang bawah tanah (ANOVA, F(3, 24) = 0,4716, P = 0,0089);(ii) duodenum dari tikus yang terinfeksi kista G. duodenalis dan diobati dengan inhibitor MCC950.vili duodenum rusak dan mati (ANOVA, F(3, 24) = 0.4903, P = 0.0144) dengan atrofi dan percabangan ruang bawah tanah (ANOVA, F(3, 24) = 0.4716, P = 0, 0481) (Gbr. 3d- F) .Hasil ini menunjukkan bahwa inflamasiom NLRP3 berperan dalam mengurangi patogenisitas G. duodenalis.
Peran inflamasiom NLRP3 pada infeksi Giardia duodenum.Tikus dilubangi (iv) dengan kista duodenokokus dan kemudian diobati dengan atau tanpa MCC950 (ip).Kelompok perlakuan tunggal dengan PBS atau MCC950 digunakan sebagai kontrol.Kelompok eksperimen dan rejimen pengobatan.b Berat badan tikus di masing-masing kelompok perlakuan dipantau selama 7 hari.Perbedaan kelompok infeksi G. duodenalis dengan kelompok perlakuan infeksi G. duodenalis + MCC950 dianalisis dengan uji t menggunakan software SPSS versi 22.0.Tanda bintang menunjukkan perbedaan signifikan pada *P<0,05, **P<0,01, atau ***P<0,001.c Beban parasit ditentukan dengan menghitung jumlah trofozoit dalam cairan lavage duodenum.Perbedaan kelompok infeksi G. duodenalis dengan kelompok perlakuan infeksi G. duodenalis + MCC950 dianalisis dengan uji t menggunakan software SPSS versi 22.0.Tanda bintang menunjukkan perbedaan signifikan pada *P < 0,05.d Pewarnaan hematoxylin dan eosin (H&E) hasil histopatologi duodenum.Panah merah menunjukkan kerusakan pada vili, panah hijau menunjukkan kerusakan pada kripta.Bilah skala: 100 µm.e, f Analisis statistik tinggi vili duodenum dan tinggi ruang bawah tanah tikus.Tanda bintang menunjukkan perbedaan yang signifikan pada *P<0,05 dan **P<0,01.Hasilnya diambil dari 7 percobaan biologis independen.BW, berat badan;ig, jalur persalinan intragastrik;ip, rute persalinan intraperitoneal;ns, tidak signifikan (P > 0,05);PBS, larutan garam dengan buffer fosfat;WT, tipe liar
Sekresi IL-1β merupakan ciri aktivasi peradangan.Untuk menentukan apakah G. duodenalis alpha-2 giardine dan alpha-7.3 giardine mengaktifkan host inflammasome NLRP3 in vivo, kami menggunakan tikus WT yang tidak diobati (kelompok palsu) dan tikus yang diblokir inflamasi NLRP3 (kelompok perlakuan yang dihambat MCC950).Skema percobaan yang rinci ditunjukkan pada Gambar 4a.Kelompok eksperimen terdiri dari tikus yang diobati dengan PBS, pengobatan kista G. duodenalis dengan gavage, injeksi pcDNA3.1 intramuskular, dan injeksi pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine atau pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine secara intramuskular.Pada hari ke 7 setelah pemberian plasmid rekombinan intramuskular, serum dikumpulkan dan kadar IL-1β pada masing-masing kelompok ditentukan.Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 4b, pada kelompok MOCK: (i) dibandingkan dengan kelompok PBS, pengobatan pcDNA3.1 tidak memiliki pengaruh yang signifikan terhadap sekresi IL-1β (ANOVA, F(4.29)=4.062, P=0.9998), namun, Sekresi IL-β meningkat secara signifikan pada kelompok kista G. duodenalis (ANOVA, F(4, 29) = 4.062, P = 0.0002), (ii) pcDNA3.1-alpha-2 giardine dan pcDNA3.1- Injeksi giardine alfa-7.3 intramuskular secara signifikan meningkatkan kadar IL-1β serum (ANOVA, F(4, 29) = 4.062, P<0.0001);(iii) pcDNA3.1-alpha-7,3 giardine menginduksi sekresi IL -1β tingkat tinggi pada kelompok injeksi intramuskular giardine pcDNA3.1-alpha-2 (ANOVA, F(4, 29) = 4.062, P = 0.0333) .Dibandingkan dengan masing-masing kelompok pada kelompok perlakuan MCC950 dan kelompok MOCK: (i) Tingkat sekresi IL-1β pada kelompok kontrol PBS dan kelompok kontrol pcDNA3.1 menurun sampai batas tertentu setelah memblokir inhibitor MCC950, tetapi perbedaannya tidak signifikan. signifikan (PBS: ANOVA, F (9, 58) = 3,540, P = 0,4912 pcDNA3.1: ANOVA, F(9, 58) = 3,540, P = 0,5949);(ii) setelah memblokir MCC950., sekresi IL-1β berkurang secara signifikan pada kelompok yang terinfeksi kista G. duodenalis, kelompok giardine pcDNA3.1-alpha-2, dan kelompok giardine pcDNA3.1-alpha-7.3 (G. duodenalis: ANOVA, F(9 , 58) = 3,540 , P = 0,0120; pcDNA3.1-alpha-2 giardin: ANOVA, F(9, 58) = 3,540, P = 0,0447; ) = 3,540, P = 0,0164).Hasil ini menunjukkan bahwa giardine alfa-2 dan giardin alfa-7.3 memediasi aktivasi inflamasiom NLRP3 in vivo.
pcDNA3.1(+)-giardine mengaktifkan inflammasome host NLRP3 in vivo.Tikus diimunisasi (IM) dengan ekspresi eukariotik rekombinan plasmid pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine atau pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardine dan kemudian diobati dengan MCC950 (kelompok ip; MCC950) atau tidak (kelompok tiruan ).Kelompok perlakuan plasmid PBS atau pcDNA3.1(+) digunakan sebagai kontrol negatif, kelompok perlakuan kista G. duodenalis digunakan sebagai kontrol positif.Kelompok eksperimen dan rejimen pengobatan.b Kadar IL-1β serum pada tikus diukur pada hari ke 7 dengan uji ELISA.Perbedaan antar kelompok pada kelompok MOCK dianalisis menggunakan one way ANOVA, dan perbedaan antara kelompok MOCK dengan kelompok MCC950 dianalisis menggunakan uji t pada software SPSS versi 22.0.Tanda bintang menunjukkan perbedaan yang signifikan antar kelompok perlakuan pada kelompok MOCK, *P<0,05 dan ***P<0,001;tanda dolar ($) menunjukkan perbedaan yang signifikan antara masing-masing kelompok pada kelompok MOCK dan kelompok MCC950 pada P<0,05.Hasil tujuh percobaan biologis independen.i, injeksi intramuskular, ns, tidak signifikan (P > 0,05)
Untuk menyelidiki efek aktivasi inflammasome inang NLRP3 yang dimediasi alpha-2 dan alpha-7.3 giardine pada infektivitas G. duodenalis, kami menggunakan tikus WT C57BL/6 dan menyuntikkan alpha-2 giardine dan alpha-7.3 giardine.Plasmid disuntikkan secara intramuskular, setelah 3 hari melalui tabung lambung kista G. duodenalis, setelah itu mencit diamati selama 7 hari.Skema percobaan yang rinci ditunjukkan pada Gambar 5a.Berat badan masing-masing mencit diukur setiap hari, sampel jaringan duodenum segar dikumpulkan pada hari ke 7 setelah pemberian melalui selang lambung, diukur jumlah trofozoitnya, dan diamati perubahan histopatologinya.Seperti terlihat pada Gambar 5b, dengan bertambahnya waktu makan, berat badan mencit pada masing-masing kelompok meningkat secara bertahap.MT mencit mulai menurun pada hari ke-3 setelah pemberian kista G. duodenalis intragastrik, kemudian meningkat secara bertahap.Aktivasi inflamasi NLRP3 yang diinduksi oleh injeksi intramuskular alpha-2 giardine dan alpha7.3 giardine secara signifikan melemahkan penurunan berat badan pada tikus (Hari 1: pcDNA3.1-alpha-2 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 1.399, P = 0 ,9754 Hari 1: pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine, ANOVA, F(4, 30)=1.399, P=0.9987 Hari 2: pcDNA3.1-alpha-2 giardine, ANOVA, F( 4, 30) = 0,3172, P = 0,9979; Hari ke-2: pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0,3172, P = 0,8409; 4, 30) = 0,8222, P = 0,0262 Hari 3: pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine, ANOVA, F(4 , 30) = 0.8222, P = 0.0083; Hari 4: pcDNA3.1-alpha-2 giardine, ANOVA , F(4, 30) = 0,5620, P = 0,0012, Hari ke-4: pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0,5620, P <0,0001, Hari ke-5: pcDNA3.1-alpha - 2 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0.9728, P <0.0001 Hari 5: pcDNA3.1-alpha -7.3 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0.9728, P <0.0001 Hari 6: pcDNA3 .1 - alpha-2 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0.7154, P = 0.0012, Hari 6: pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0.7154, P = 0.0006;Hari 7: pcDNA3.1-alpha-2 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0.5369, P<0.0001 Hari 7: pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine, ANOVA, F(4 , 30) = 0.5369, P <0,0001).Beban parasit dinilai di duodenum (Gambar 5c).Dibandingkan dengan kontrol positif yang tidak diobati dan kelompok yang disuntik dengan vektor pcDNA3.1 kosong, jumlah trofozoit G. duodenalis berkurang secara signifikan pada kelompok yang disuntik dengan α-2 giardine dan α-7,3 giardine (pcDNA3.1-alpha -2 giardine : ANOVA, F(3, 24) = 1.209, P = 0.0002, pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine: ANOVA, F(3, 24) = 1.209, P<0.0001).Selain itu, giardine alfa-7.3 lebih protektif pada tikus dibandingkan giardine alfa-2 (ANOVA, F(3, 24) = 1.209, P = 0.0081).Hasil pewarnaan HE ditunjukkan pada gambar.5d–f.Tikus yang disuntik dengan alpha-2 giardine dan alpha-7.3 giardine memiliki lebih sedikit lesi jaringan duodenum, yang dimanifestasikan oleh kerusakan vili, dibandingkan dengan tikus yang disuntik dengan G. duodenalis dan tikus yang disuntik dengan G. duodenalis dalam kombinasi dengan vektor pcDNA3 kosong .1 Zoom.(pcDNA3.1-alpha-2 giardine: ANOVA, F(3, 24) = 2.466, P = 0.0035 atau P = 0.0068; pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine: ANOVA, F(3, 24) = 2.466, P = 0,0028 atau P = 0,0055) dan pengurangan atrofi ruang bawah tanah (pcDNA3.1-alpha-2 giardine: ANOVA, F(3, 24) = 1.470, P = 0.0264 atau P = 0.0158; pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine: ANOVA , F(3, 24) = 1,470, P = 0,0371 atau P = 0,0191).Hasil ini menunjukkan bahwa alpha-2 giardine dan alpha-7,3 giardine mengurangi infektivitas G. duodenalis dengan mengaktifkan inflammasome NLRP3 in vivo.
Peran pcDNA3.1(+)-giardin pada infeksi G. duodenalis.Tikus diimunisasi (IM) dengan plasmid ekspresi eukariotik rekombinan pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine atau pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardine dan kemudian ditantang dengan kista G. duodenalis (ig).Kelompok PBS dan kelompok pengobatan pcDNA3.1(+) + kista duodenum digunakan sebagai kelompok kontrol negatif, dan kelompok pengobatan kista duodenum digunakan sebagai kelompok kontrol positif.Kelompok eksperimen dan rejimen pengobatan.b MT tikus di masing-masing kelompok perlakuan dipantau selama 7 hari pasca tantangan.Tanda bintang menunjukkan perbedaan yang signifikan antara kelompok pada kelompok G. duodenalis dan kelompok giardine pcDNA3.1(+)-alpha-2, *P <0,05, **P <0,01, dan ***P <0,001;tanda dolar ($) menunjukkan perbedaan yang signifikan antara masing-masing kelompok G. duodenalis dan kelompok jardine pcDNA3.1(+)-alpha-7.3, $$P<0,01 dan $$$P<0,001.c Beban parasit ditentukan dengan menghitung jumlah trofozoit dalam 1 ml lavage duodenum dari duodenum (panjang 3 cm) dan dinyatakan sebagai jumlah parasit per cm duodenum.Perbedaan antara kelompok infeksi G. duodenalis, kelompok giardine pcDNA3.1(+)-alpha-2, dan kelompok giardine pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 dianalisis dengan one way ANOVA menggunakan software SPSS versi 22.0.Tanda bintang menunjukkan perbedaan yang signifikan pada **P<0,01 dan ***P<0,001.d Perubahan histopatologi pada duodenum.Panah merah menunjukkan kerusakan pada vili, panah hijau menunjukkan kerusakan pada kripta.Bilah skala: 100 µm.e, f Analisis statistik tinggi vili duodenum tikus (e) dan tinggi ruang bawah tanah (f).Perbedaan antar kelompok pada Gambar 1d dianalisis dengan ANOVA satu arah menggunakan perangkat lunak SPSS versi 22.0.Tanda bintang menunjukkan perbedaan yang signifikan pada *P<0,05 dan **P<0,01.Hasil tujuh percobaan biologis independen.ns, tidak signifikan (P > 0,05)
Giardia duodenum adalah parasit usus manusia dan mamalia lain yang menyebabkan giardiasis.Pada tahun 2004, penyakit ini dimasukkan dalam Inisiatif Penyakit Terabaikan WHO karena prevalensinya yang tinggi selama 6 tahun, terutama di komunitas dengan status sosial ekonomi rendah [32].Sistem kekebalan bawaan memainkan peran penting dalam respon imun terhadap infeksi G. duodenalis.Makrofag tikus telah dilaporkan menelan dan membunuh G. duodenalis dengan melepaskan perangkap ekstraseluler [33].Penelitian kami sebelumnya menunjukkan bahwa G. duodenalis, parasit ekstraseluler non-invasif, mengaktifkan jalur pensinyalan inflamasi p38 MAPK, ERK, NF-κB p65, dan NLRP3 pada makrofag tikus untuk mengatur respons inflamasi inang, dan pelepasan GEV dapat meningkatkan proses ini.13], 24].Namun, PAMP yang terlibat dalam peradangan yang diatur oleh inflamasi NLRP3 pada GEV dan peran inflamasiom NLRP3 pada giardiasis masih harus dijelaskan.Untuk menjelaskan dua pertanyaan ini, kami melakukan penelitian ini.
Inflammasome NLRP3 terletak di sitoplasma sel imun dan dapat diaktifkan oleh berbagai partikel seperti kristal asam urat, racun, bakteri, virus, dan parasit.Dalam penelitian bakteri, racun telah diidentifikasi sebagai PAMP utama yang mengaktifkan sensor inflamasi, yang menyebabkan peradangan dan kematian sel [34].Beberapa racun yang secara struktural beragam, seperti hemolysin dari Staphylococcus aureus [35] dan Escherichia coli [36], hemolysin BL (HBL) dari enterotoksin (NHE) [37], menginduksi aktivasi peradangan NLRP3.Penelitian virus menunjukkan bahwa protein virulensi seperti protein envelope (E) SARS-COV-2 [38] dan protein NS5 virus Zika [39] adalah PAMP penting yang dikenali oleh reseptor NLRP3.Dalam penelitian parasit, banyak parasit telah dilaporkan berhubungan dengan aktivasi inflammasom inang, seperti Toxoplasma gondii, Trichomonas vaginalis [40], Trypanosoma cruzi [41], dan Leishmania [42].Protein granula padat GRA35, GRA42, dan GRA43, terkait dengan virulensi Toxoplasma gondii, diperlukan untuk induksi piroptosis pada makrofag tikus Lewis [43].Selain itu, beberapa penelitian Leishmania berfokus pada molekul individu yang terlibat dalam inflamasiom NLRP3, seperti lipofosfoglikan membran parasit (44) atau zinc metalloprotease (45).Di antara keluarga gen alpha-giardin yang mirip annexin, alpha-1 giardin telah terbukti menjadi kandidat vaksin potensial yang memberikan perlindungan terhadap G. duodenalis pada model tikus [18].Dalam penelitian kami, kami memilih faktor virulensi G. duodenalis alpha-2 dan alpha-7,3 giardines, yang unik untuk giardia tetapi relatif lebih sedikit dilaporkan.Kedua gen target ini diklon ke vektor sistem ekspresi eukariotik pcDNA3.1(+) untuk analisis aktivasi peradangan.
Dalam model tikus kami, fragmen caspase yang terpecah berfungsi sebagai penanda aktivasi inflamasi.Setelah stimulasi, NLRP3 berinteraksi dengan ASC, merekrut procaspases, dan menghasilkan caspases aktif yang memecah pro-IL-1β dan pro-IL-18 menjadi IL-1β dan IL-18 matang, masing-masing -18.Caspases inflamasi (caspases-1, -4, -5 dan -11) adalah keluarga protease sistein yang dilestarikan yang sangat penting untuk pertahanan bawaan dan terlibat dalam peradangan dan kematian sel terprogram [46].Caspase-1 diaktifkan oleh inflammasom kanonik [47], sedangkan caspase-4, -5, dan -11 dibelah selama pembentukan inflammasom atipikal [48].Dalam penelitian ini, kami menggunakan makrofag peritoneum tikus sebagai model dan menyelidiki p20 caspase-1 yang membelah caspase-1 sebagai penanda aktivasi peradangan inang NLRP3 dalam studi infeksi G. duodenalis.Hasilnya menunjukkan bahwa banyak alpha-giardin bertanggung jawab atas aktivasi peradangan yang khas, yang konsisten dengan penemuan molekul virulensi utama yang terlibat dalam bakteri dan virus.Namun, penelitian kami hanyalah pemeriksaan awal dan terdapat molekul lain yang dapat mengaktifkan inflammasom non-klasik, karena penelitian kami sebelumnya menemukan inflammasom klasik dan non-klasik pada infeksi G. duodenalis [13].Untuk menentukan lebih lanjut apakah p20 caspase-1 yang dihasilkan dikaitkan dengan inflamasiom NLRP3, kami mentransfeksi giardin alfa-2 dan alfa-7.3 menjadi makrofag peritoneum tikus untuk menentukan tingkat ekspresi protein molekul kunci dan tingkat oligomerisasi ASC, yang memastikan bahwa kedua α-giardin aktif. NLRP3 yang menyebabkan peradangan.Hasil kami sedikit berbeda dari Manko-Prykhoda et al., yang melaporkan bahwa stimulasi sel Caco-2 dengan strain G. muris atau E. coli EPEC saja dapat meningkatkan intensitas fluoresensi NLRP3, ASC, dan caspase-1, meskipun tidak secara signifikan, sedangkan bagaimana kostimulasi G. muris dan E. coli meningkatkan kadar ketiga protein tersebut [49].Perbedaan ini mungkin disebabkan oleh perbedaan pemilihan spesies Giardia, garis sel, dan sel primer.Kami juga melakukan pengujian in vivo menggunakan MCC950 pada tikus WT C57BL/6 betina berumur 5 minggu, yang lebih rentan terhadap G. duodenalis.MCC950 adalah penghambat NLRP3 molekul kecil yang kuat dan selektif yang menghambat aktivasi NLRP3 kanonik dan non-kanonik pada konsentrasi nanomolar.MCC950 menghambat aktivasi NLRP3 tetapi tidak mempengaruhi aktivasi jalur inflamasi AIM2, NLRC4, dan NLRP1 atau jalur pensinyalan TLR [27].MCC950 memblokir aktivasi NLRP3 tetapi tidak menghambat inisiasi NLRP3, penghabisan K+, masuknya Ca2+, atau interaksi antara NLRP3 dan ASC;sebaliknya, ia menghambat aktivasi inflamasiom NLRP3 dengan memblokir oligomerisasi ASC [27].Oleh karena itu, kami menggunakan MCC950 dalam penelitian in vivo untuk menentukan peran inflamasiom NLRP3 setelah injeksi giardine.Caspase-1 p10 yang teraktivasi memecah sitokin proinflamasi pro-IL-1β dan pro-IL-18 menjadi IL-1β dan IL-18 matang [50].Dalam penelitian ini, kadar serum IL-1β pada tikus yang diobati dengan giardine dengan atau tanpa MCC950 digunakan sebagai indikator apakah inflamasiom NLRP3 diaktifkan.Seperti yang diharapkan, pengobatan MCC950 secara signifikan mengurangi kadar IL-1β serum.Data ini dengan jelas menunjukkan bahwa G. duodenalis giardin alfa-2 dan giardin alfa-7.3 mampu mengaktifkan inflammasome tikus NLRP3.
Data signifikan yang terakumulasi selama dekade terakhir telah menunjukkan bahwa IL-17A adalah pengatur utama imunitas terhadap G. muris, menginduksi sinyal IL-17RA, memproduksi peptida antimikroba, dan mengatur aktivasi komplemen [51].Namun, infeksi Giardia lebih sering terjadi pada tikus dewasa muda, dan telah dilaporkan bahwa infeksi Giardia pada tikus muda tidak mengaktifkan respons IL-17A untuk memberikan efek perlindungannya [52], sehingga mendorong para peneliti untuk mencari Giardia imunomodulator lainnya.mekanisme infeksi cacing.Penulis penelitian baru-baru ini melaporkan bahwa G. muris dapat mengaktifkan inflamasiom NLRP3 oleh E. coli EPEC, yang mendorong produksi peptida antimikroba dan mengurangi kapasitas perlekatannya serta jumlah trofozoit di saluran usus, sehingga mengurangi keparahan penyakit usus besar. penyakit yang disebabkan oleh basil [49 ].Peradangan NLRP3 terlibat dalam perkembangan berbagai penyakit.Penelitian telah menunjukkan bahwa Pseudomonas aeruginosa memicu autophagy pada makrofag untuk menghindari kematian sel, dan proses ini bergantung pada aktivasi inflamasiom NLRP3 [53].Untuk N. caninum, aktivasi inflamasiom NLRP3 yang dimediasi oleh spesies oksigen reaktif membatasi replikasinya di inang, menjadikannya target terapi potensial [9].Paracoccidioides brasiliensis telah ditemukan menginduksi aktivasi inflamasiom NLRP3 pada sel dendritik yang berasal dari sumsum tulang tikus, menghasilkan pelepasan sitokin inflamasi IL-1β, yang memainkan peran penting dalam pertahanan inang [10].Beberapa spesies Leishmania, termasuk L. amazonensis, L. mayor, L. braziliensis, dan L. infantum chagasi, mengaktifkan NLRP3 dan caspase-1 yang bergantung pada ASC pada makrofag, serta infeksi Leishmania.Replikasi parasit ditingkatkan pada tikus yang kekurangan gen NLRP3/ASC/caspase-1 [11].Zamboni dkk.Infeksi Leishmania telah dilaporkan menginduksi aktivasi inflamasiom NLRP3 di makrofag, yang membatasi replikasi parasit intraseluler.Dengan demikian, Leishmania dapat menghambat aktivasi NLRP3 sebagai strategi penghindaran.Studi in vivo, inflamasiom NLRP3 berkontribusi terhadap penghapusan Leishmania, namun tidak mempengaruhi jaringan [54].Sebaliknya, dalam studi helminthiasis, aktivasi inflamasiom NLRP3 menekan imunitas protektif pejamu terhadap helminthiasis gastrointestinal [12].Shigella adalah salah satu bakteri utama penyebab diare di seluruh dunia.Bakteri ini dapat menginduksi produksi IL-1β melalui penghabisan K+ yang dimediasi reseptor P2X7, spesies oksigen reaktif, pengasaman lisosom, dan kerusakan mitokondria.Peradangan NLRP3 secara negatif mengatur fagositosis dan aktivitas bakterisida makrofag terhadap Shigella (55).Penelitian terhadap Plasmodium menunjukkan bahwa tikus yang kekurangan AIM2, NLRP3 atau caspase-1 yang terinfeksi Plasmodium menghasilkan interferon tipe 1 tingkat tinggi dan lebih tahan terhadap infeksi Plasmodium [56].Namun, peran alpha-2 giardine dan alpha-7.3 giardine dalam menginduksi aktivasi patogen peradangan NLRP3 pada tikus masih belum jelas.
Dalam penelitian ini, penghambatan inflamasiom NLRP3 oleh MCC950 mengurangi berat badan dan meningkatkan jumlah trofozoit dalam cairan lavage usus pada tikus, mengakibatkan perubahan patologis yang lebih parah pada jaringan duodenum.Giardin alfa-2 dan giardin alfa-7.3 mengaktifkan inflamasi NLRP3 tikus inang, meningkatkan berat badan tikus, mengurangi jumlah trofozoit dalam cairan bilas usus, dan meringankan lesi duodenum patologis.Hasil ini menunjukkan bahwa G. duodenalis dapat mengaktifkan inflammasome inang NLRP3 melalui alpha-2 giardine dan alpha-7,3 giardine, sehingga mengurangi patogenisitas G. duodenalis pada tikus.
Secara kolektif, hasil kami menunjukkan bahwa giardine alfa-2 dan alfa-7.3 menginduksi aktivasi inflammasome inang NLRP3 dan mengurangi infektivitas G. duodenalis pada tikus.Oleh karena itu, molekul-molekul ini merupakan target yang menjanjikan untuk pencegahan giardiasis.
       Data supporting the results of this study can be obtained from the respective author at gongpt@jlu.edu.cn.
Liang AKS, Liang AAM, Huang AHC, Sergi KM, Kam JKM.Giardiasis: gambaran umum.Baru-baru ini terungkap bahwa Pat Inflamm alergi terhadap obat-obatan.2019;13:134–43.
Escobedo AA, Tsimerman S. Giardiasis: review farmakoterapi.Pendapat Ahli seorang apoteker.2007;8: 1885–902.
Tian Huafeng, Chen Bin, Wen Jianfeng.Giardiasis, resistensi obat dan penemuan target baru.Menginfeksi target obat Disord.2010;10:295–302.
Wang Z, Zhang X, Xiao Yi, Zhang W, Wu X, Qin T, dll. Penyakit inflamasi dan peradangan NLRP3.Sel Med Oksida Panjang Umur.2020;2020:4063562.
Chen GY, Núñez G. Peran inflammasome dalam peradangan usus dan kanker.Gastroenterologi.2011;141:1986–99.
Pellegrini C, Antonioli L, Lopez-Castejon G, Blandizzi C, Fornai M. Aktivasi inflamasiom NLRP3 kanonik dan atipikal di persimpangan toleransi imun dan peradangan usus.pra-imun.2017;8:36.
Li L, Wang XC, Gong PT, Zhang N, Zhang X, Li S, dkk.Aktivasi inflamasiom NLRP3 yang dimediasi ROS terlibat dalam respons terhadap infeksi N. caninum.Vektor parasit.2020;13:449.