Terima kasih telah mengunjungi Alam.com.Versi browser yang Anda gunakan memiliki dukungan CSS yang terbatas.Untuk pengalaman terbaik, kami menyarankan Anda menggunakan browser yang diperbarui (atau nonaktifkan Mode Kompatibilitas di Internet Explorer).Sementara itu, untuk memastikan dukungan yang berkelanjutan, kami akan merender situs tanpa gaya dan JavaScript.
Toxoplasma gondii adalah parasit protozoa intraseluler yang memodulasi lingkungan mikro dari inang yang terinfeksi dan diketahui terkait dengan kejadian pertumbuhan tumor otak.Dalam penelitian ini, kami berhipotesis bahwa exosomal miRNA-21 dari infeksi Toxoplasma mendorong pertumbuhan tumor otak.Eksosom dari mikroglia BV2 yang terinfeksi Toxoplasma dikarakterisasi dan internalisasi sel glioma U87 dikonfirmasi.Profil ekspresi microRNA exosomal dianalisis menggunakan array microRNA dan microRNA-21A-5p yang terkait dengan Toxoplasma gondii dan pemilahan tumor.Kami juga menyelidiki level mRNA dari gen terkait tumor dalam sel glioma U87 dengan mengubah level miR-21 dalam eksosom dan efek eksosom pada proliferasi sel glioma U87 manusia.Pada eksosom sel glioma U87 yang terinfeksi Toxoplasma gondii, ekspresi microRNA-21 meningkat dan aktivitas gen antitumor (FoxO1, PTEN, dan PDCD4) berkurang.Eksosom turunan BV2 yang terinfeksi Toksoplasma menginduksi proliferasi sel glioma U87.Eksosom menginduksi pertumbuhan sel U87 dalam model tumor tikus.Kami menyarankan bahwa peningkatan miR-21 eksosomal pada mikroglia BV2 yang terinfeksi Toxoplasma dapat memainkan peran penting sebagai promotor pertumbuhan sel dalam sel glioma U87 dengan menurunkan regulasi gen antitumor.
Diperkirakan lebih dari 18,1 juta kasus kanker stadium lanjut didiagnosis di seluruh dunia pada tahun 2018, dengan sekitar 297.000 tumor sistem saraf pusat didiagnosis setiap tahun (1,6% dari semua tumor)1.Penelitian sebelumnya telah menunjukkan bahwa faktor risiko untuk mengembangkan tumor otak manusia meliputi berbagai produk kimia, riwayat keluarga, dan radiasi pengion dari peralatan terapi dan diagnostik kepala.Namun, penyebab pasti dari keganasan ini tidak diketahui.Sekitar 20% dari semua kanker di seluruh dunia disebabkan oleh agen infeksius, termasuk virus, bakteri, dan parasit3,4.Patogen menular mengganggu mekanisme genetik sel inang, seperti perbaikan DNA dan siklus sel, dan dapat menyebabkan peradangan kronis dan kerusakan pada sistem kekebalan5.
Agen infeksi yang terkait dengan kanker manusia adalah patogen virus yang paling umum, termasuk human papillomavirus dan virus hepatitis B dan C.Parasit juga dapat memainkan peran potensial dalam perkembangan kanker pada manusia.Beberapa spesies parasit, yaitu Schistosoma, Opishorchis viverrini, O. felineus, Clonorchis sinensis dan Hymenolepis nana, telah terlibat dalam berbagai jenis kanker manusia 6,7,8.
Toxoplasma gondii adalah protozoa intraseluler yang mengatur lingkungan mikro sel inang yang terinfeksi.Parasit ini diperkirakan menginfeksi sekitar 30% populasi dunia, menempatkan seluruh populasi dalam risiko9,10.Toxoplasma gondii dapat menginfeksi organ vital, termasuk sistem saraf pusat (SSP), dan menyebabkan penyakit serius seperti meningitis dan ensefalitis yang fatal, terutama pada pasien dengan gangguan kekebalan9.Namun, Toxoplasma gondii juga dapat mengubah lingkungan inang yang terinfeksi dengan memodulasi pertumbuhan sel dan respon imun pada individu imunokompeten, yang mengarah ke pemeliharaan infeksi kronis tanpa gejala9,11.Menariknya, mengingat korelasi antara prevalensi T. gondii dan kejadian tumor otak, beberapa laporan menunjukkan bahwa perubahan lingkungan host in vivo akibat infeksi T. gondii kronis menyerupai lingkungan mikro tumor.
Eksosom dikenal sebagai komunikator antar sel yang mengirimkan konten biologis, termasuk protein dan asam nukleat, dari sel tetangga16,17.Eksosom dapat memengaruhi proses biologis terkait tumor seperti anti-apoptosis, angiogenesis, dan metastasis di lingkungan mikro tumor.Secara khusus, miRNAs (miRNAs), RNA non-coding kecil dengan panjang sekitar 22 nukleotida, adalah regulator gen pasca-transkripsi penting yang mengontrol lebih dari 30% mRNA manusia melalui kompleks pembungkaman yang diinduksi miRNA (miRISC).Toxoplasma gondii dapat mengganggu proses biologis dengan mengontrol ekspresi miRNA pada inang yang terinfeksi.MiRNA inang mengandung sinyal penting untuk mengatur proses biologis inang untuk mencapai strategi kelangsungan hidup parasit.Dengan demikian, mempelajari perubahan profil miRNA inang setelah terinfeksi T. gondii dapat membantu kita memahami interaksi antara inang dan T. gondii dengan lebih jelas.Memang, Thirugnanam et al.15 menyarankan bahwa T. gondii mendorong karsinogenesis otak dengan mengubah ekspresinya pada miRNA inang spesifik yang terkait dengan pertumbuhan tumor dan menemukan bahwa T. gondii dapat menyebabkan glioma pada hewan percobaan.
Penelitian ini berfokus pada perubahan exosomal miR-21 pada mikroglia inang yang terinfeksi Toxoplasma BV2.Kami mengamati kemungkinan peran miR-21 eksosomal yang diubah dalam pertumbuhan sel glioma U87 karena retensi dalam nukleus FoxO1 / p27, yang merupakan target miR-21 yang diekspresikan secara berlebihan.
Eksosom yang berasal dari BV2 diperoleh dengan menggunakan sentrifugasi diferensial dan divalidasi dengan berbagai metode untuk mencegah kontaminasi dengan komponen seluler atau vesikel lainnya.Elektroforesis gel poliakrilamida SDS (SDS-PAGE) menunjukkan pola yang berbeda antara protein yang diekstraksi dari sel BV2 dan eksosom (Gambar 1A), dan sampel dinilai untuk keberadaan Alix, yang dianalisis dengan Western blotting penanda protein eksosom pada .Pelabelan Alix ditemukan pada protein eksosom tetapi tidak pada protein lisat sel BV2 (Gbr. 1B).Selain itu, RNA murni dari eksosom yang berasal dari BV2 dianalisis menggunakan bioanalyzer.Subunit ribosom 18S dan 28S jarang diamati dalam pola migrasi RNA eksosom, menunjukkan kemurnian yang dapat diandalkan (Gambar 1C).Akhirnya, mikroskop elektron transmisi menunjukkan bahwa eksosom yang diamati berukuran sekitar 60-150 nm dan memiliki struktur seperti cangkir yang khas dari morfologi eksosom (Gbr. 1D).
Karakterisasi eksosom yang berasal dari sel BV2.(A) Halaman lembar data keselamatan.Protein diisolasi dari sel BV2 atau eksosom yang berasal dari BV2.Pola protein berbeda antara sel dan eksosom.(B) Analisis western blot dari penanda eksosomal (Alix).( C ) Evaluasi RNA murni dari sel BV2 dan eksosom turunan BV2 menggunakan bioanalyzer.Dengan demikian, subunit ribosom 18S dan 28S dalam sel BV2 jarang ditemukan pada RNA eksosom.( D ) Mikroskop elektron transmisi menunjukkan bahwa eksosom yang diisolasi dari sel BV2 diwarnai secara negatif dengan uranil asetat 2%.Eksosom berukuran sekitar 60-150 nm dan berbentuk cangkir (Song dan Jung, data tidak dipublikasikan).
Internalisasi seluler dari eksosom turunan BV2 ke dalam sel glioma manusia U87 diamati menggunakan mikroskop confocal.Eksosom berlabel PKH26 terlokalisasi dalam sitoplasma sel U87.Nuklei diwarnai dengan DAPI (Gbr. 2A), menunjukkan bahwa eksosom turunan BV2 dapat diinternalisasi oleh sel inang dan memengaruhi lingkungan sel penerima.
Internalisasi eksosom turunan BV2 ke dalam sel glioma U87 dan eksosom turunan BV2 yang terinfeksi Toxoplasma RH menginduksi proliferasi sel glioma U87.( A ) Eksosom yang ditelan oleh sel U87 diukur dengan mikroskop confocal.Sel glioma U87 diinkubasi dengan eksosom berlabel PKH26 (merah) atau tanpa kontrol selama 24 jam.Inti diwarnai dengan DAPI (biru) dan kemudian diamati di bawah mikroskop confocal (bar skala: 10 μm, x 3000).( B ) proliferasi sel glioma U87 ditentukan dengan uji proliferasi sel.Sel glioma U87 diobati dengan eksosom untuk waktu yang ditentukan. *P <0,05 diperoleh dengan uji t Student. *P <0,05 diperoleh dengan uji t Student. *P < 0,05 получено по t-критерию Стьюдента. * P <0,05 dengan uji-t Student. *P <0,05 通过学生t 检验获得。 * P <0,05 * P < 0,05, полученный с помощью t-критерия Стьюдента. * P <0,05 diperoleh dengan menggunakan Student's t-test.
Setelah mengonfirmasi internalisasi eksosom turunan BV2 ke dalam sel glioma U87, kami melakukan uji proliferasi sel untuk menyelidiki peran eksosom turunan Toksoplasma turunan BV2 dalam perkembangan sel glioma manusia.Pengobatan sel U87 dengan eksosom dari sel BV2 yang terinfeksi T. gondii menunjukkan bahwa eksosom turunan BV2 yang terinfeksi T. gondii menyebabkan proliferasi sel U87 yang jauh lebih tinggi dibandingkan dengan kontrol (Gbr. 2B).
Selain itu, pertumbuhan sel U118 memiliki hasil yang sama dengan U87, karena eksosom yang distimulasi Toxoplasma menyebabkan tingkat proliferasi tertinggi (data tidak ditampilkan).Berdasarkan data ini, kami dapat menunjukkan bahwa eksosom yang terinfeksi Toxoplasma yang berasal dari BV2 memainkan peran penting dalam proliferasi sel glioma.
Untuk menyelidiki efek dari eksosom turunan BV2 yang terinfeksi Toxoplasma pada perkembangan tumor, kami menyuntikkan sel glioma U87 ke tikus telanjang untuk model xenograft dan menyuntikkan eksosom turunan BV2 atau eksosom turunan BV2 yang terinfeksi RH.Setelah tumor menjadi jelas setelah 1 minggu, masing-masing kelompok percobaan yang terdiri dari 5 tikus dibagi menurut ukuran tumor untuk menentukan titik awal yang sama, dan ukuran tumor diukur selama 22 hari.
Pada tikus dengan model xenograft U87, ukuran dan berat tumor yang secara signifikan lebih besar diamati pada kelompok eksosom yang terinfeksi RH yang diturunkan dari BV2 pada hari ke 22 (Gbr. 3A, B).Di sisi lain, tidak ada perbedaan yang signifikan dalam ukuran tumor antara kelompok eksosom turunan BV2 dan kelompok kontrol setelah pengobatan eksosom.Selain itu, tikus yang disuntik dengan sel glioma dan eksosom secara visual menampilkan volume tumor terbesar dalam kelompok eksosom turunan BV2 yang terinfeksi RH (Gbr. 3C).Hasil ini menunjukkan bahwa eksosom yang terinfeksi Toxoplasma yang diturunkan dari BV2 menginduksi pertumbuhan glioma dalam model tumor tikus.
Onkogenesis (AC) dari eksosom turunan BV2 dalam model tikus xenograft U87.Ukuran tumor ( A ) dan berat ( B ) meningkat secara signifikan pada tikus telanjang BALB / c yang diobati dengan eksosom yang terinfeksi RH yang berasal dari BV2.Tikus telanjang BALB / c ( C ) disuntikkan secara subkutan dengan 1 x 107 sel U87 yang disuspensi dalam campuran Matrigel.Enam hari setelah injeksi, 100 μg eksosom turunan BV2 dirawat pada tikus.Ukuran dan berat tumor masing-masing diukur pada hari-hari yang ditentukan dan setelah pengorbanan. * P <0,05. * P <0,05. *P < 0,05. * P <0,05. * P <0,05。 * P <0,05。 *P < 0,05. * P <0,05.
Data menunjukkan bahwa 37 miRNA (16 diekspresikan berlebih dan 21 diekspresikan ke bawah) terkait dengan imunitas atau perkembangan tumor secara signifikan diubah dalam mikroglia setelah infeksi dengan strain Toxoplasma RH (Gbr. 4A).Tingkat ekspresi relatif miR-21 di antara miRNA yang diubah dikonfirmasi oleh RT-PCR waktu-nyata dalam eksosom yang berasal dari BV2, eksosom yang diobati dengan sel BV2 dan U87.Ekspresi miR-21 menunjukkan peningkatan signifikan pada eksosom dari sel BV2 yang terinfeksi Toxoplasma gondii (strain RH) (Gbr. 4B).Tingkat ekspresi relatif miR-21 dalam sel BV2 dan U87 meningkat setelah pengambilan eksosom yang diubah (Gbr. 4B).Tingkat relatif ekspresi miR-21 di jaringan otak pasien tumor dan tikus yang terinfeksi Toxoplasma gondii (strain ME49) masing-masing lebih tinggi daripada kontrol (Gbr. 4C).Hasil ini berkorelasi dengan perbedaan antara tingkat ekspresi mikroRNA yang diprediksi dan dikonfirmasi secara in vitro dan in vivo.
Perubahan ekspresi exosomal miP-21a-5p pada mikroglia yang terinfeksi Toxoplasma gondii (RH).( A ) Menunjukkan perubahan signifikan pada siRNA yang terkait dengan kekebalan atau perkembangan tumor setelah infeksi T. gondii RH.( B ) Tingkat ekspresi miR-21 relatif terdeteksi oleh RT-PCR waktu-nyata dalam eksosom turunan BV2, eksosom yang diobati dengan BV2, dan sel U87.( C ) Tingkat ekspresi miR-21 relatif ditemukan di jaringan otak pasien tumor (N = 3) dan tikus yang terinfeksi Toxoplasma gondii (strain ME49) (N = 3). *P <0,05 diperoleh dengan uji t Student. *P <0,05 diperoleh dengan uji t Student. *P < 0,05 было получено с помощью t-критерия Стьюдента. * P <0,05 diperoleh dengan menggunakan uji-t Student. *P <0,05 通过学生t 检验获得。 * P <0,05 * P <0,05, полученный с помощью t-критерия Стьюдента. * P <0,05 diperoleh dengan menggunakan Student's t-test.
Eksosom dari sel BV2 yang terinfeksi RH menyebabkan pertumbuhan glioma in vivo dan in vitro (Gbr. 2, 3).Untuk mendeteksi mRNA yang relevan, kami memeriksa level mRNA dari gen target antitumor, forkhead box O1 (FoxO1), PTEN, dan kematian sel terprogram 4 (PDCD4) dalam sel U87 yang terinfeksi dengan eksosom yang berasal dari BV2 atau RH BV2.Analisis bioinformatika telah menunjukkan bahwa beberapa gen terkait tumor, termasuk gen FoxO1, PTEN, dan PDCD4, memiliki situs pengikatan miR-2121,22.Tingkat mRNA dari gen target antitumor berkurang pada eksosom turunan BV2 yang terinfeksi RH dibandingkan dengan eksosom turunan BV2 (Gbr. 5A).FoxO1 menunjukkan penurunan kadar protein pada eksosom turunan BV2 yang terinfeksi RH dibandingkan dengan eksosom turunan BV2 (Gambar 5B).Berdasarkan hasil ini, kami dapat mengonfirmasi bahwa eksosom yang berasal dari BV2 yang terinfeksi RH menurunkan regulasi gen anti-onkogenik, mempertahankan peran mereka dalam pertumbuhan tumor.
Eksosom turunan BV2 yang terinfeksi Toxoplasma RH menginduksi penekanan gen antitumor dalam sel glioma U87 oleh eksosom turunan BV2 yang terinfeksi Toxoplasma RH.( A ) PCR real-time dari ekspresi FoxO1, PTEN dan PDCD4 dalam eksosom yang berasal dari BV2 yang terinfeksi T. gondii RH dibandingkan dengan eksosom PBS.mRNA β-aktin digunakan sebagai kontrol.(B) Ekspresi FoxO1 ditentukan oleh Western blotting dan data densitometri dievaluasi secara statistik menggunakan program ImageJ. *P <0,05 diperoleh dengan uji t Student. *P <0,05 diperoleh dengan uji t Student. *P < 0,05 было получено с помощью t-критерия Стьюдента. * P <0,05 diperoleh dengan menggunakan uji-t Student. *P <0,05 通过学生t 检验获得。 * P <0,05 * P <0,05, полученный с помощью t-критерия Стьюдента. * P <0,05 diperoleh dengan menggunakan Student's t-test.
Untuk memahami efek miP-21 dalam eksosom pada regulasi gen terkait tumor, sel U87 ditransfusikan dengan penghambat miP-21 menggunakan Lipofectamine 2000 dan sel dipanen 24 jam setelah transfeksi.Tingkat ekspresi FoxO1 dan p27 dalam sel yang ditransfeksi dengan inhibitor miR-21 dibandingkan dengan sel yang diobati dengan eksosom turunan BV2 menggunakan qRT-PCR (Gbr. 6A, B).Transfeksi inhibitor miR-21 ke dalam sel U87 menurunkan regulasi ekspresi FoxO1 dan p27 secara signifikan (Gbr. 6).
miP-21 turunan BV2 eksosomal yang terinfeksi RH mengubah ekspresi FoxO1 / p27 dalam sel glioma U87.Sel U87 ditransfeksi dengan inhibitor miP-21 menggunakan Lipofectamine 2000 dan sel dipanen 24 jam setelah transfeksi.Tingkat ekspresi FoxO1 dan p27 dalam sel yang ditransfusikan dengan inhibitor miR-21 dibandingkan dengan tingkat dalam sel yang diobati dengan eksosom turunan BV2 menggunakan qRT-PCR (A, B).
Untuk menghindari respon imun inang, parasit Toxoplasma berubah menjadi kista jaringan.Mereka menjadi parasit pada berbagai jaringan, termasuk otak, jantung, dan otot rangka, sepanjang hidup inang dan memodulasi respons imun inang.Selain itu, mereka dapat mengatur siklus sel dan apoptosis sel inang, mendorong proliferasi14,24.Toxoplasma gondii sebagian besar menginfeksi sel dendritik inang, neutrofil, dan garis turunan monosit/makrofag, termasuk mikroglia otak.Toxoplasma gondii menginduksi diferensiasi makrofag fenotipe M2, mempengaruhi penyembuhan luka setelah infeksi patogen, dan juga berhubungan dengan hipervaskularisasi dan fibrosis granulomatosa.Patogenesis perilaku infeksi Toksoplasma ini mungkin terkait dengan penanda yang terkait dengan perkembangan tumor.Lingkungan bermusuhan yang diatur oleh Toxoplasma mungkin menyerupai prakanker yang sesuai.Oleh karena itu, dapat diasumsikan bahwa infeksi toksoplasma berkontribusi terhadap perkembangan tumor otak.Faktanya, tingkat infeksi Toxoplasma yang tinggi telah dilaporkan pada serum pasien dengan berbagai tumor otak.Selain itu, Toxoplasma gondii mungkin merupakan efektor karsinogenik lainnya dan bertindak secara sinergis untuk membantu karsinogen menular lainnya mengembangkan tumor otak.Dalam hal ini, perlu dicatat bahwa P. falciparum dan virus Epstein-Barr secara sinergis berkontribusi pada pembentukan limfoma Burkitt.
Peran eksosom sebagai pengatur dalam bidang penelitian kanker telah banyak diteliti.Namun, peran eksosom antara parasit dan inang yang terinfeksi masih kurang dipahami.Sejauh ini, berbagai regulator, termasuk protein yang disekresikan, telah menjelaskan proses biologis dimana parasit protozoa melawan serangan inang dan melanggengkan infeksi.Baru-baru ini, ada konsep yang berkembang bahwa mikrovesikel terkait protozoa dan mikroRNA mereka berinteraksi dengan sel inang untuk menciptakan lingkungan yang menguntungkan bagi kelangsungan hidup mereka.Oleh karena itu, penelitian lebih lanjut diperlukan untuk menemukan hubungan antara perubahan miRNA eksosom dan proliferasi sel glioma.Perubahan MicroRNA (gen cluster miR-30c-1, miR-125b-2, miR-23b-27b-24-1 dan miR-17-92) berikatan dengan promotor STAT3 dalam makrofag manusia yang terinfeksi toxoplasma, diatur dan menginduksi anti -apoptosis sebagai respon terhadap infeksi Toxoplasma gondii 29 .Infeksi toksoplasma meningkatkan ekspresi miR-17-5p dan miR-106b-5p, yang berkaitan dengan beberapa penyakit hiperproliferatif 30 .Data ini menunjukkan bahwa miRNA inang yang diatur oleh infeksi Toxoplasma adalah molekul penting untuk kelangsungan hidup parasit dan patogenesis dalam perilaku biologis inang.
MiRNA yang berubah dapat memengaruhi berbagai jenis perilaku selama inisiasi dan perkembangan sel ganas, termasuk glioma: swasembada sinyal pertumbuhan, ketidakpekaan terhadap sinyal penghambat pertumbuhan, penghindaran apoptosis, potensi replikasi tak terbatas, angiogenesis, invasi dan metastasis, dan peradangan.Pada glioma, miRNA yang berubah telah diidentifikasi dalam beberapa studi profil ekspresi.
Dalam penelitian ini, kami mengonfirmasi ekspresi miRNA-21 tingkat tinggi dalam sel inang yang terinfeksi toksoplasma.miR-21 telah diidentifikasi sebagai salah satu mikroRNA yang paling sering diekspresikan berlebih pada tumor padat, termasuk glioma, 33 dan ekspresinya berkorelasi dengan derajat glioma.Akumulasi bukti menunjukkan bahwa miR-21 adalah onkogen baru yang bertindak sebagai faktor anti-apoptosis dalam pertumbuhan glioma dan sangat diekspresikan secara berlebihan dalam jaringan dan plasma keganasan otak manusia.Menariknya, inaktivasi miR-21 pada sel dan jaringan glioma memicu penghambatan proliferasi sel karena apoptosis yang bergantung pada caspase.Analisis bioinformatik dari target prediksi miR-21 mengungkapkan beberapa gen penekan tumor yang terkait dengan jalur apoptosis, termasuk kematian sel terprogram 4 (PDCD4), tropomiosin (TPM1), PTEN, dan kotak forkhead O1 (FoxO1), dengan situs pengikatan miR-2121..22.38.
FoxO1, sebagai salah satu faktor transkripsi (FoxO), terlibat dalam perkembangan berbagai jenis kanker manusia dan dapat mengatur ekspresi gen penekan tumor seperti p21, p27, Bim, dan FasL40.FoxO1 dapat mengikat dan mengaktifkan penghambat siklus sel seperti p27 untuk menekan pertumbuhan sel.Selain itu, FoxO1 adalah efektor utama pensinyalan PI3K/Akt dan mengatur banyak proses biologis seperti perkembangan siklus sel dan diferensiasi sel melalui aktivasi transkripsi p2742.
Sebagai kesimpulan, kami percaya bahwa exosomal miR-21 yang berasal dari mikroglia yang terinfeksi Toxoplasma dapat memainkan peran penting sebagai pengatur pertumbuhan sel glioma (Gbr. 7).Namun, penelitian lebih lanjut diperlukan untuk menemukan hubungan langsung antara exosomal miR-21, infeksi Toxoplasma yang berubah, dan pertumbuhan glioma.Hasil ini diharapkan dapat memberikan titik awal untuk mempelajari hubungan antara infeksi Toxoplasma dan kejadian glioma.
Diagram skematik mekanisme karsinogenesis glioma (otak) diusulkan dalam penelitian ini.Penulis menggambar di PowerPoint 2019 (Microsoft, Redmond, WA).
Semua protokol eksperimental dalam penelitian ini, termasuk penggunaan hewan, sesuai dengan Perawatan Hewan Universitas Nasional Seoul dan Panduan Etika Standar Komite Pengguna dan telah disetujui oleh Dewan Peninjau Institusi Fakultas Kedokteran Universitas Nasional Seoul (nomor IRB SNU- 150715).-2).Semua prosedur eksperimental dilakukan sesuai dengan rekomendasi ARRIVE.
Mikroglia tikus BV2 dan sel glioma manusia U87 dikultur dalam Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM; Welgene, Seoul, Korea) dan Roswell Park Memorial Institute's Medium (RPMI; Welgene), masing-masing, masing-masing mengandung 10% serum janin sapi, 4 mM l- glutamin, 0,2 mM penisilin dan 0,05 mM streptomisin.Sel dikultur dalam inkubator dengan 5% CO2 pada suhu 37°C.Garis sel glioma lainnya, U118, digunakan untuk perbandingan dengan sel U87.
Untuk mengisolasi eksosom dari strain RH dan ME49 yang terinfeksi T. gondii, T. gondii tachyzoites (strain RH) dipanen dari rongga perut tikus BALB / c berumur 6 minggu yang disuntikkan 3-4 hari sebelumnya.Tachyzoites dicuci tiga kali dengan PBS dan dimurnikan dengan sentrifugasi dalam 40% Percoll (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)43.Untuk mendapatkan takizoit strain ME49, mencit BALB/c diinjeksi secara intraperitoneal dengan 20 jaringan kista dan transformasi takizoit dalam kista dikumpulkan dengan mencuci rongga perut pada hari ke 6-8 setelah infeksi (PI).Tikus terinfeksi PBS.Takizoit ME49 ditanam dalam sel yang dilengkapi dengan penisilin 100 μg/ml (Gibco/BRL, Grand Island, NY, AS), streptomisin 100 μg/ml (Gibco/BRL), dan serum janin sapi 5% (Lonza, Walkersville, MD ) .., USA) pada 37 °C dan 5% karbon dioksida.Setelah kultivasi dalam sel Vero, takizoit ME49 dilewatkan dua kali melalui jarum ukuran 25 dan kemudian melalui filter 5 µm untuk menghilangkan kotoran dan sel.Setelah dicuci, takizoit disuspensikan kembali dalam PBS44.Kista jaringan Toxoplasma gondii strain ME49 dipertahankan dengan injeksi kista intraperitoneal yang diisolasi dari otak tikus C57BL / 6 yang terinfeksi (Orient Bio Animal Center, Seongnam, Korea).Otak tikus yang terinfeksi ME49 dipanen setelah 3 bulan PI dan dicacah di bawah mikroskop untuk mengisolasi kista.Tikus yang terinfeksi disimpan dalam kondisi bebas patogen khusus (SPF) di Fakultas Kedokteran Universitas Nasional Seoul.
Total RNA diekstraksi dari eksosom turunan BV2, sel dan jaringan BV2 menggunakan miRNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden, Jerman) sesuai dengan instruksi pabrik, termasuk waktu inkubasi untuk langkah elusi.Konsentrasi RNA ditentukan pada spektrofotometer NanoDrop 2000.Kualitas microarray RNA dinilai menggunakan bioanalyzer Agilent 2100 (Agilent Technologies, Amstelveen, Belanda).
DMEM dengan 10% exosome-poor FBS disiapkan dengan ultrasentrifugasi pada 100.000g selama 16 jam pada suhu 4°C dan disaring melalui filter 0,22 µm (Nalgene, Rochester, NY, USA).Sel BV2, 5 × 105, dikultur dalam DMEM yang mengandung 10% FBS yang terkuras eksosom dan 1% antibiotik pada suhu 37 ° C dan 5% CO2.Setelah 24 jam inkubasi, takizoit strain RH atau ME49 (MOI = 10) ditambahkan ke sel dan parasit yang tidak menyerang dihilangkan dalam waktu satu jam dan diisi ulang dengan DMEM.Eksosom dari sel BV2 diisolasi dengan sentrifugasi diferensial yang dimodifikasi, metode yang paling banyak digunakan.Suspensikan kembali pelet eksosom dalam 300 µl PBS untuk analisis RNA atau protein.Konsentrasi eksosom yang diisolasi ditentukan menggunakan alat uji protein BCA (Pierce, Rockford, IL, USA) dan spektrofotometer NanoDrop 2000.
Endapan dari sel BV2 atau eksosom yang berasal dari BV2 dilisiskan dalam larutan ekstraksi protein PRO-PREP™ (iNtRon Biotechnology, Seongnam, Korea) dan protein dimasukkan ke dalam gel poliakrilamida SDS 10% berwarna biru cemerlang Coomassie.Selain itu, protein dipindahkan ke membran PVDF selama 2 jam.Western blot divalidasi menggunakan antibodi Alix (Cell Signaling Technology, Beverly, MA, USA) sebagai penanda eksosom.HRP-conjugated goat anti-mouse IgG (H + L) (Bethyl Laboratories, Montgomery, TX, USA) dan penganalisa gambar LAS-1000 plus luminescent (Fuji Photographic Film, Tokyo, Jepang) digunakan sebagai antibodi sekunder..Mikroskop elektron transmisi dilakukan untuk mempelajari ukuran dan morfologi eksosom.Eksosom yang diisolasi dari sel BV2 (6,40 µg/µl) disiapkan pada jaring berlapis karbon dan diwarnai negatif dengan 2% uranil asetat selama 1 menit.Sampel yang disiapkan diamati pada tegangan percepatan 80 kV menggunakan JEOL 1200-EX II (Tokyo, Jepang) yang dilengkapi dengan kamera ES1000W Erlangshen CCD (Gatan, Pleasanton, CA, USA).
Eksosom turunan BV2 diwarnai menggunakan PKH26 Red Fluorescent Linker Kit (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) selama 15 menit pada suhu kamar.Sel U87, 2×105, dengan eksosom berlabel PKH26 (merah) atau tanpa eksosom sebagai kontrol negatif, diinkubasi pada suhu 37°C selama 24 jam dalam inkubator CO2 5%.Inti sel U87 diwarnai dengan DAPI (biru), sel U87 difiksasi dalam paraformaldehyde 4% selama 15 menit pada suhu 4 ° C dan kemudian dianalisis dalam sistem mikroskop confocal Leica TCS SP8 STED CW (Leica Microsystems, Mannheim, Jerman).tampak.
cDNA disintesis dari siRNA menggunakan sintesis untai pertama Mir-X siRNA dan kit SYBR qRT-PCR (Takara Bio Inc., Shiga, Jepang).PCR kuantitatif waktu nyata dilakukan menggunakan sistem deteksi PCR waktu nyata iQ5 (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) menggunakan primer dan templat yang dicampur dengan SYBR Premix.DNA diamplifikasi selama 40 siklus denaturasi pada 95°C selama 15 detik dan annealing pada 60°C selama 60 detik.Data dari setiap reaksi PCR dianalisis menggunakan modul analisis data perangkat lunak sistem optik iQ™5 (Bio-Rad).Perubahan relatif dalam ekspresi gen antara gen target terpilih dan β-aktin/siRNA (dan U6) dihitung menggunakan metode kurva standar.Urutan primer yang digunakan ditunjukkan pada Tabel 1.
3 x 104 sel glioma U87 diunggulkan dalam 96-well plate dan dicampur dengan eksosom yang terinfeksi Toxoplasma yang berasal dari BV2 (50 μg/mL) atau eksosom nonpulse yang berasal dari BV2 (50 μg/mL) sebagai kontrol pada 12, 18 dan 36 jam .Tingkat proliferasi sel ditentukan menggunakan Cell Counting Kit-8 (Dojindo, Kumamoto, Jepang) (Angka Tambahan S1-S3) 46 .
Tikus telanjang BALB / c betina berumur 5 minggu dibeli dari Orient Bio (Seongnam-si, Korea Selatan) dan disimpan secara terpisah di kandang steril pada suhu kamar (22 ± 2 ° C) dan kelembaban (45 ± 15 ° C).%) pada suhu kamar (22±2°C) dan kelembapan (45±15%).Siklus cahaya 12 jam dan siklus gelap 12 jam dilakukan di bawah SPF (Pusat Hewan Fakultas Kedokteran Universitas Nasional Seoul).Tikus secara acak dibagi menjadi tiga kelompok masing-masing 5 tikus dan semua kelompok disuntikkan secara subkutan dengan 400 ml PBS yang mengandung 1 x 107 sel glioma U87 dan faktor pertumbuhan mengurangi BD Matrigel ™ (BD Science, Miami, FL, USA).Enam hari setelah injeksi tumor, 200 mg eksosom yang berasal dari sel BV2 (dengan/tanpa infeksi Toxoplasma) disuntikkan ke lokasi tumor.Dua puluh dua hari setelah infeksi tumor, ukuran tumor tikus pada masing-masing kelompok diukur dengan caliper tiga kali seminggu, dan volume tumor dihitung dengan rumus: 0,5×(lebar)×2×panjang.
Analisis ekspresi mikroRNA menggunakan larik miRNA miRCURYTM LNA, generasi ke-7 memiliki, larik mmu dan rno (EXIQON, Vedbaek, Denmark) yang mencakup 1119 tikus yang dikarakterisasi dengan baik di antara 3100 probe penangkap miRNA manusia, tikus dan tikus.Selama prosedur ini, 250 hingga 1000 ng RNA total dihilangkan dari 5′-fosfat dengan pengobatan dengan alkali fosfatase usus betis diikuti dengan pelabelan dengan pewarna fluoresen hijau Hy3.Sampel berlabel kemudian digabungkan dengan memuat slide microarray menggunakan kit ruang hibridisasi (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) dan kit slide hibridisasi (Agilent Technologies).Hibridisasi dilakukan selama 16 jam pada suhu 56°C, kemudian microarray dicuci sesuai dengan rekomendasi pabrikan.Slide microarray yang diproses kemudian dipindai menggunakan sistem pemindai microarray Agilent G2565CA (Agilent Technologies).Gambar yang dipindai diimpor menggunakan perangkat lunak Agilent Feature Extraction versi 10.7.3.1 (Agilent Technologies) dan intensitas fluoresensi setiap gambar dihitung menggunakan file GAL yang sesuai dari protokol Exiqon yang dimodifikasi.Data microarray untuk studi saat ini disimpan dalam database GEO dengan nomor tambahan GPL32397.
Profil ekspresi miRNA eksosom dewasa dalam mikroglia strain RH atau ME49 yang terinfeksi Toxoplasma dianalisis menggunakan berbagai alat jaringan.miRNA yang terkait dengan perkembangan tumor diidentifikasi menggunakan miRWalk2.0 (//mirwalk.umm.uni-heidelberg.de) dan disaring dengan intensitas sinyal yang dinormalisasi (log2) lebih besar dari 8.0.Di antara miRNA, miRNA yang diekspresikan secara berbeda ditemukan lebih dari 1,5 kali lipat diubah oleh analisis filter miRNA yang diubah oleh strain RH atau ME49 yang terinfeksi T. gondii.
Sel diunggulkan dalam pelat enam sumur (3 x 105 sel / sumur) di opti-MEM (Gibco, Carlsbad, CA, USA) menggunakan Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA).Sel-sel yang ditransfusikan dikultur selama 6 jam dan kemudian media diubah menjadi media segar lengkap.Sel dipanen 24 jam setelah transfeksi.
Analisis statistik terutama dilakukan dengan menggunakan Student's t-test dengan perangkat lunak Excel (Microsoft, Washington, DC, USA).Untuk analisis hewan percobaan, ANOVA dua arah dilakukan menggunakan perangkat lunak Prism 3.0 (Perangkat Lunak GraphPad, La Jolla, CA, USA). Nilai-P <0,05 dianggap signifikan secara statistik. Nilai-P <0,05 dianggap signifikan secara statistik. Значения P <0,05 считались статистически значимыми. Nilai P <0,05 dianggap signifikan secara statistik. P 值< 0.05 被认为具有统计学意义。 P 值 < 0,05 Значения P <0,05 считались статистически значимыми. Nilai P <0,05 dianggap signifikan secara statistik.
Semua protokol eksperimental yang digunakan dalam penelitian ini telah disetujui oleh Institutional Review Board of the Seoul National University School of Medicine (nomor IRB SNU-150715-2).
The data used in this study are available upon reasonable request from the first author (BK Jung; mulddang@snu.ac.kr). And the microarray data for the current study is deposited in the GEO database under registration number GPL32397.
Furley, J. et al.Estimasi kejadian dan kematian kanker global pada tahun 2018: sumber dan metode GLOBOCAN.Penafsiran.J. Ruck 144, 1941–1953 (2019).
Rasheed, S., Rehman, K. & Akash, MS Wawasan tentang faktor risiko tumor otak dan intervensi terapeutiknya. Rasheed, S., Rehman, K. & Akash, MS Wawasan tentang faktor risiko tumor otak dan intervensi terapeutiknya.Rashid, S., Rehman, K. dan Akash, MS Tinjauan faktor risiko tumor otak dan intervensi terapeutik utama. Rasheed, S., Rehman, K. & Akash, MS Rasheed, S., Rehman, K. & Akash, MS Pemahaman mendalam tentang faktor risiko tumor otak dan intervensi terapeutik.Rashid, S., Rehman, K. dan Akash, MS Tinjauan faktor risiko tumor otak dan intervensi terapeutik utama.Ilmu biomedis.Apoteker.143, 112119 (2021).
Kato, I., Zhang, J. & Sun, J. Interaksi bakteri-virus pada kanker saluran kelamin manusia dan organ pencernaan wanita: Ringkasan bukti epidemiologi dan laboratorium. Kato, I., Zhang, J. & Sun, J. Interaksi bakteri-virus pada kanker saluran kelamin manusia dan organ pencernaan wanita: Ringkasan bukti epidemiologi dan laboratorium.Kato I., Zhang J. dan Sun J. Interaksi bakteri-virus pada kanker saluran pencernaan manusia dan saluran genital wanita: ringkasan data epidemiologi dan laboratorium. Kato, I., Zhang, J. & Sun, J. Kato, I., Zhang, J. & Sun, J. Interaksi bakterio-virus dalam pencernaan rongga mulut manusia dan saluran reproduksi wanita: ringkasan ilmu penyakit populer dan bukti laboratorium.Kato I., Zhang J. dan Sun J. Interaksi bakteri-virus pada kanker gastrointestinal manusia dan kanker genital wanita: ringkasan data epidemiologi dan laboratorium.Kanker 14, 425 (2022).
Magon, KL & Parish, JL Dari infeksi menjadi kanker: Bagaimana virus tumor DNA mengubah karbon pusat sel inang dan metabolisme lipid. Magon, KL & Parish, JL Dari infeksi menjadi kanker: Bagaimana virus tumor DNA mengubah karbon pusat sel inang dan metabolisme lipid.Mahon, KL and Parish, JL Infeksi api menjadi kanker: bagaimana virus tumor berbasis DNA mengubah karbon pusat sel inang dan metabolisme lipid. Magon, KL & Parish, JL 从感染到癌症：DNA 肿瘤病毒如何改变宿主细胞的中心碳和脂质代谢。 Magon, KL & Parish, JL Dari infeksi menjadi kanker: bagaimana virus tumor DNA mengubah karbon pusat sel inang dan metabolisme lipid.Mahon, KL and Parish, JL Membakar infeksi menjadi kanker: bagaimana virus tumor DNA mengubah metabolisme karbon dan lipid sentral dalam sel inang.Biologi Terbuka.11, 210004 (2021).
Correia da Costa, JM dkk.Estrogen katekol dari schistosomes dan cacing hati dan kanker terkait cacing.depan.panas di dalam.5, 444 (2014).