Terima kasih telah mengunjungi Alam.com.Versi browser yang Anda gunakan memiliki dukungan CSS yang terbatas.Untuk pengalaman terbaik, kami menyarankan Anda menggunakan browser yang diperbarui (atau nonaktifkan Mode Kompatibilitas di Internet Explorer).Sementara itu, untuk memastikan dukungan yang berkelanjutan, kami akan merender situs tanpa gaya dan JavaScript.
Vektor gen untuk pengobatan fibrosis kistik paru harus ditargetkan ke saluran udara konduktif, karena transduksi paru perifer tidak memiliki efek terapeutik.Efisiensi transduksi virus berhubungan langsung dengan waktu tinggal pembawa.Namun, cairan pengiriman seperti pembawa gen secara alami berdifusi ke dalam alveoli selama inhalasi, dan partikel terapeutik dalam bentuk apa pun dengan cepat dihilangkan dengan transportasi mukosiliar.Memperpanjang waktu tinggal pembawa gen di saluran pernapasan penting tetapi sulit dicapai.Partikel magnetik terkonjugasi pembawa yang dapat diarahkan ke permukaan saluran pernapasan dapat meningkatkan penargetan regional.Karena masalah dengan pencitraan in vivo, perilaku partikel magnetik kecil seperti itu pada permukaan jalan napas dengan adanya medan magnet yang diterapkan kurang dipahami.Tujuan dari penelitian ini adalah untuk menggunakan pencitraan synchrotron untuk memvisualisasikan secara in vivo pergerakan serangkaian partikel magnetik dalam trakea tikus yang dianestesi untuk mempelajari dinamika dan pola perilaku partikel tunggal dan massal in vivo.Kami kemudian juga menilai apakah pengiriman partikel magnetik lentiviral dengan adanya medan magnet akan meningkatkan efisiensi transduksi pada trakea tikus.Pencitraan sinar-X Synchrotron menunjukkan perilaku partikel magnetik dalam medan magnet stasioner dan bergerak secara in vitro dan in vivo.Partikel tidak dapat dengan mudah diseret melintasi permukaan saluran udara hidup menggunakan magnet, tetapi selama pengangkutan, endapan terkonsentrasi di bidang pandang, di mana medan magnet paling kuat.Efisiensi transduksi juga meningkat enam kali lipat ketika partikel magnetik lentiviral dikirim dengan adanya medan magnet.Secara keseluruhan, hasil ini menunjukkan bahwa partikel magnetik lentiviral dan medan magnet mungkin merupakan pendekatan yang berharga untuk meningkatkan penargetan vektor gen dan tingkat transduksi dalam saluran udara konduktif in vivo.
Cystic fibrosis (CF) disebabkan oleh variasi dalam gen tunggal yang disebut regulator konduktansi transmembran CF (CFTR).Protein CFTR adalah saluran ion yang ada di banyak sel epitel di seluruh tubuh, termasuk saluran udara, tempat utama dalam patogenesis fibrosis kistik.Cacat pada CFTR menyebabkan transportasi air yang tidak normal, dehidrasi permukaan saluran napas, dan penurunan kedalaman lapisan cairan permukaan saluran napas (ASL).Ini juga merusak kemampuan sistem transpor mukosiliar (MCT) untuk membersihkan saluran udara dari partikel dan patogen yang terhirup.Tujuan kami adalah untuk mengembangkan terapi gen lentiviral (LV) untuk mengirimkan salinan gen CFTR yang benar dan meningkatkan kesehatan ASL, MCT, dan paru-paru, serta terus mengembangkan teknologi baru yang dapat mengukur parameter ini secara in vivo1.
Vektor LV adalah salah satu kandidat utama untuk terapi gen cystic fibrosis, terutama karena mereka dapat mengintegrasikan gen terapeutik secara permanen ke dalam sel basal saluran napas (sel induk saluran napas).Ini penting karena mereka dapat mengembalikan hidrasi normal dan pembersihan lendir dengan berdiferensiasi menjadi sel permukaan saluran napas yang dikoreksi gen fungsional yang terkait dengan fibrosis kistik, menghasilkan manfaat seumur hidup.Vektor LV harus diarahkan ke saluran udara konduktif, karena di sinilah keterlibatan paru-paru dalam CF dimulai.Pengiriman vektor lebih dalam ke paru-paru dapat menyebabkan transduksi alveolar, tetapi ini tidak memiliki efek terapeutik pada fibrosis kistik.Namun, cairan seperti pembawa gen secara alami bermigrasi ke dalam alveoli ketika dihirup setelah melahirkan3,4 dan partikel terapeutik dengan cepat dikeluarkan ke dalam rongga mulut oleh MCT.Efisiensi transduksi LV secara langsung terkait dengan lamanya waktu vektor tetap dekat dengan sel target untuk memungkinkan pengambilan seluler – “waktu tinggal” 5 yang mudah dipersingkat oleh aliran udara regional yang khas serta pengambilan lendir dan partikel MCT yang terkoordinasi.Untuk cystic fibrosis, kemampuan untuk memperpanjang waktu tinggal LV di saluran udara penting untuk mencapai transduksi tingkat tinggi di area ini, tetapi sejauh ini merupakan tantangan.
Untuk mengatasi rintangan ini, kami mengusulkan bahwa partikel magnetik LV (MP) dapat membantu dalam dua cara yang saling melengkapi.Pertama, mereka dapat dipandu oleh magnet ke permukaan jalan napas untuk meningkatkan penargetan dan membantu partikel pembawa gen berada di area jalan napas yang tepat;dan ASL) pindah ke lapisan sel 6. MP digunakan secara luas sebagai kendaraan penghantaran obat yang ditargetkan ketika mereka berikatan dengan antibodi, obat kemoterapi, atau molekul kecil lainnya yang menempel pada membran sel atau berikatan dengan reseptor permukaan sel masing-masing dan menumpuk di lokasi tumor di adanya listrik statis.Medan magnet untuk terapi kanker 7. Metode "hipertermik" lainnya ditujukan untuk membunuh sel tumor dengan memanaskan MP ketika terkena medan magnet berosilasi.Prinsip transfeksi magnetik, di mana medan magnet digunakan sebagai agen transfeksi untuk meningkatkan transfer DNA ke dalam sel, biasanya digunakan secara in vitro menggunakan serangkaian vektor gen non-virus dan virus untuk garis sel yang sulit ditransduksi. ..Efisiensi magnetotransfeksi LV dengan pengiriman LV MP in vitro ke dalam garis sel epitel bronkial manusia dengan adanya medan magnet statis ditetapkan, meningkatkan efisiensi transduksi sebesar 186 kali dibandingkan dengan vektor LV saja.LV MT juga telah diterapkan pada model in vitro fibrosis kistik, di mana transfeksi magnetik meningkatkan transduksi LV dalam kultur antarmuka udara-cair dengan faktor 20 di hadapan sputum fibrosis kistik10.Namun, magnetotransfeksi organ in vivo telah menerima perhatian yang relatif sedikit dan hanya dievaluasi dalam beberapa penelitian hewan11,12,13,14,15, terutama di paru-paru16,17.Namun, kemungkinan transfeksi magnetik dalam terapi paru pada fibrosis kistik sudah jelas.Tan dkk.(2020) menyatakan bahwa “studi validasi pada pengiriman nanopartikel magnetik paru yang efektif akan membuka jalan bagi strategi inhalasi CFTR di masa depan untuk meningkatkan hasil klinis pada pasien dengan cystic fibrosis”6.
Perilaku partikel magnetik kecil pada permukaan saluran pernapasan di hadapan medan magnet terapan sulit untuk divisualisasikan dan dipelajari, dan karenanya kurang dipahami.Dalam penelitian lain, kami telah mengembangkan metode Synchrotron Propagation Based Phase Contrast X-Ray Imaging (PB-PCXI) untuk pencitraan non-invasif dan kuantifikasi perubahan menit in vivo pada kedalaman ASL18 dan perilaku MCT19,20 untuk secara langsung mengukur hidrasi permukaan saluran gas dan digunakan sebagai indikator awal efektivitas pengobatan.Selain itu, metode penilaian MCT kami menggunakan partikel berdiameter 10–35 µm yang terdiri dari alumina atau kaca indeks bias tinggi sebagai penanda MCT yang terlihat dengan PB-PCXI21.Kedua metode cocok untuk pencitraan berbagai jenis partikel, termasuk MP.
Karena resolusi spasial dan temporal yang tinggi, pengujian ASL dan MCT berbasis PB-PCXI kami sangat cocok untuk mempelajari dinamika dan pola perilaku partikel tunggal dan massal in vivo untuk membantu kami memahami dan mengoptimalkan metode pengiriman gen MP.Pendekatan yang kami gunakan di sini didasarkan pada penelitian kami menggunakan sinar SPring-8 BL20B2, di mana kami memvisualisasikan pergerakan cairan setelah pengiriman dosis vektor dummy ke saluran udara hidung dan paru tikus untuk membantu menjelaskan pola ekspresi gen heterogen kami yang diamati. dalam gen kita.studi hewan dengan dosis pembawa 3,4 .
Tujuan dari penelitian ini adalah untuk menggunakan sinkronisasi PB-PCXI untuk memvisualisasikan gerakan in vivo dari serangkaian MP di trakea tikus hidup.Studi pencitraan PB-PCXI ini dirancang untuk menguji seri MP, kekuatan medan magnet, dan lokasi untuk menentukan pengaruhnya terhadap pergerakan MP.Kami berasumsi bahwa medan magnet eksternal akan membantu MF yang dikirim tetap atau pindah ke area target.Studi ini juga memungkinkan kami untuk menentukan konfigurasi magnet yang memaksimalkan jumlah partikel yang tersisa di trakea setelah pengendapan.Dalam studi seri kedua, kami bertujuan untuk menggunakan konfigurasi optimal ini untuk menunjukkan pola transduksi yang dihasilkan dari pengiriman LV-MP in vivo ke saluran napas tikus, dengan asumsi bahwa pengiriman LV-MP dalam konteks penargetan saluran napas akan menghasilkan dalam peningkatan efisiensi transduksi LV..
Semua penelitian pada hewan dilakukan sesuai dengan protokol yang disetujui oleh University of Adelaide (M-2019-060 dan M-2020-022) dan Komite Etika Hewan Synchrotron SPring-8.Eksperimen dilakukan sesuai dengan rekomendasi dari ARRIVE.
Semua gambar x-ray diambil pada beamline BL20XU di sinkrotron SPring-8 di Jepang menggunakan pengaturan yang mirip dengan yang dijelaskan sebelumnya21,22.Singkatnya, kotak percobaan terletak 245 m dari cincin penyimpanan sinkrotron.Jarak sampel ke detektor 0,6 m digunakan untuk studi pencitraan partikel dan 0,3 m untuk studi pencitraan in vivo untuk menciptakan efek fase kontras.Sinar monokromatik dengan energi 25 keV digunakan.Gambar diperoleh menggunakan transduser sinar-X resolusi tinggi (SPring-8 BM3) yang dipasangkan dengan detektor sCMOS.Transduser mengubah sinar-X menjadi cahaya tampak menggunakan sintilator setebal 10 µm (Gd3Al2Ga3O12), yang kemudian diarahkan ke sensor sCMOS menggunakan tujuan mikroskop ×10 (NA 0,3).Detektor sCMOS adalah Orca-Flash4.0 (Hamamatsu Photonics, Jepang) dengan ukuran array 2048 × 2048 piksel dan ukuran piksel mentah 6,5 × 6,5 µm.Pengaturan ini memberikan ukuran piksel isotropik efektif sebesar 0,51 µm dan bidang pandang sekitar 1,1 mm × 1,1 mm.Durasi paparan 100 ms dipilih untuk memaksimalkan rasio signal-to-noise dari partikel magnetik di dalam dan di luar saluran udara sambil meminimalkan artefak gerakan yang disebabkan oleh pernapasan.Untuk studi in vivo, rana sinar-X cepat ditempatkan di jalur sinar-X untuk membatasi dosis radiasi dengan memblokir sinar sinar-X di antara paparan.
Media LV tidak digunakan dalam studi pencitraan SPring-8 PB-PCXI karena ruang pencitraan BL20XU tidak bersertifikat Biosafety Level 2.Alih-alih, kami memilih rangkaian MP yang berkarakteristik baik dari dua vendor komersial yang mencakup berbagai ukuran, bahan, konsentrasi besi, dan aplikasi, — pertama untuk memahami bagaimana medan magnet memengaruhi pergerakan MP di kapiler kaca, lalu di saluran udara hidup.permukaan.Ukuran MP bervariasi dari 0,25 hingga 18 µm dan terbuat dari berbagai bahan (lihat Tabel 1), tetapi komposisi masing-masing sampel, termasuk ukuran partikel magnetik dalam MP, tidak diketahui.Berdasarkan studi MCT kami yang ekstensif 19, 20, 21, 23, 24, kami berharap bahwa MP hingga 5 µm dapat dilihat pada permukaan jalan napas trakea, misalnya, dengan mengurangi bingkai berurutan untuk melihat peningkatan visibilitas gerakan MP.Satu MP 0,25 µm lebih kecil dari resolusi perangkat pencitraan, tetapi PB-PCXI diharapkan dapat mendeteksi kontras volumetriknya dan pergerakan cairan permukaan tempat mereka disimpan setelah disimpan.
Sampel untuk setiap MP dalam tabel.1 disiapkan dalam 20 μl kaca kapiler (Drummond Microcaps, PA, USA) dengan diameter internal 0,63 mm.Partikel corpuscular tersedia dalam air, sedangkan partikel CombiMag tersedia dalam cairan milik pabrikan.Setiap tabung diisi setengahnya dengan cairan (kira-kira 11 µl) dan ditempatkan pada tempat sampel (lihat Gambar 1).Kapiler kaca masing-masing ditempatkan secara horizontal di atas panggung di ruang pencitraan, dan diposisikan di tepi cairan.Magnet cangkang nikel berdiameter 19 mm (panjang 28 mm) yang terbuat dari tanah jarang, neodymium, besi, dan boron (NdFeB) (N35, kucing. No. LM1652, Jaycar Electronics, Australia) dengan remanensi 1,17 T dipasang ke a pisahkan tabel transfer untuk mencapai Ubah posisi Anda dari jarak jauh selama rendering.Pencitraan sinar-X dimulai ketika magnet diposisikan kira-kira 30 mm di atas sampel dan gambar diperoleh pada 4 bingkai per detik.Selama pencitraan, magnet didekatkan ke tabung kapiler kaca (pada jarak sekitar 1 mm) dan kemudian dipindahkan sepanjang tabung untuk menilai pengaruh kekuatan medan dan posisi.
Pengaturan pencitraan in vitro yang berisi sampel MP dalam kapiler kaca pada tahap translasi sampel xy.Jalur berkas sinar-X ditandai dengan garis putus-putus berwarna merah.
Setelah visibilitas in vitro MPs ditetapkan, subset dari mereka diuji in vivo pada tikus albino Wistar betina tipe liar (~ 12 minggu, ~ 200 g).Medetomidine 0,24 mg/kg (Domitor®, Zenoaq, Jepang), midazolam 3,2 mg/kg (Dormicum®, Astellas Pharma, Jepang) dan butorphanol 4 mg/kg (Vetorphale®, Meiji Seika).Tikus dibius dengan campuran Pharma (Jepang) dengan injeksi intraperitoneal.Setelah anestesi, mereka disiapkan untuk pencitraan dengan menghilangkan bulu di sekitar trakea, memasukkan tabung endotrakeal (ET; kanula intravena 16 Ga, Terumo BCT), dan melumpuhkan mereka dalam posisi terlentang pada pelat pencitraan yang dibuat khusus yang berisi kantong termal. untuk menjaga suhu tubuh.22. Pelat pencitraan kemudian dilekatkan pada tahap sampel di kotak pencitraan dengan sedikit miring untuk menyelaraskan trakea secara horizontal pada gambar x-ray seperti yang ditunjukkan pada Gambar 2a.
( a ) Pengaturan pencitraan in vivo di unit pencitraan SPring-8, jalur berkas sinar-X ditandai dengan garis putus-putus merah.(b, c) Lokalisasi magnet trakea dilakukan dari jarak jauh menggunakan dua kamera IP yang dipasang secara ortogonal.Di sisi kiri gambar di layar, Anda dapat melihat lingkaran kawat yang menahan kepala dan kanula pengiriman dipasang di dalam tabung ET.
Sistem pompa jarum suntik yang dikendalikan dari jarak jauh (UMP2, World Precision Instruments, Sarasota, FL) menggunakan jarum suntik kaca 100 µl dihubungkan ke tabung PE10 (OD 0,61 mm, ID 0,28 mm) menggunakan jarum 30 Ga.Tandai selang untuk memastikan bahwa ujungnya berada pada posisi yang benar di trakea saat memasukkan selang endotrakeal.Menggunakan pompa mikro, pendorong jarum suntik dilepas dan ujung tabung direndam dalam sampel MP yang akan dikirim.Tabung pengiriman yang dimuat kemudian dimasukkan ke dalam tabung endotrakeal, menempatkan ujungnya di bagian terkuat dari medan magnet yang kami harapkan.Akuisisi gambar dikontrol menggunakan detektor napas yang terhubung ke kotak waktu berbasis Arduino kami, dan semua sinyal (misalnya, suhu, pernapasan, buka/tutup rana, dan akuisisi gambar) direkam menggunakan Powerlab dan LabChart (AD Instruments, Sydney, Australia) 22 Saat Pencitraan Saat housing tidak tersedia, dua kamera IP (Panasonic BB-SC382) diposisikan sekitar 90° satu sama lain dan digunakan untuk mengontrol posisi magnet relatif terhadap trakea selama pencitraan (Gambar 2b, c).Untuk meminimalkan artefak gerak, satu gambar per napas diperoleh selama dataran tinggi aliran pernapasan terminal.
Magnet dipasang ke tahap kedua, yang mungkin terletak jauh di bagian luar badan pencitraan.Berbagai posisi dan konfigurasi magnet diuji, termasuk: ditempatkan pada sudut kira-kira 30° di atas trakea (konfigurasi ditunjukkan pada Gambar 2a dan 3a);satu magnet di atas binatang dan yang lainnya di bawah, dengan kutub diatur untuk menarik (Gambar 3b)., satu magnet di atas hewan dan satu di bawah, dengan kutub diatur untuk tolakan (Gambar 3c), dan satu magnet di atas dan tegak lurus dengan trakea (Gambar 3d).Setelah menyiapkan hewan dan magnet dan memuat MP yang diuji ke dalam pompa jarum suntik, berikan dosis 50 µl dengan kecepatan 4 µl/detik setelah perolehan gambar.Magnet kemudian digerakkan bolak-balik sepanjang atau melintasi trakea sambil terus memperoleh gambar.
Konfigurasi magnet untuk pencitraan in vivo (a) satu magnet di atas trakea pada sudut kira-kira 30°, (b) dua magnet dikonfigurasi untuk tarik-menarik, (c) dua magnet dikonfigurasi untuk tolakan, (d) satu magnet di atas dan tegak lurus terhadap batang tenggorok.Pengamat melihat ke bawah dari mulut ke paru-paru melalui trakea dan sinar X-ray melewati sisi kiri tikus dan keluar dari sisi kanan.Magnet digerakkan sepanjang jalan napas atau kiri dan kanan di atas trakea ke arah sinar X-ray.
Kami juga berusaha menentukan visibilitas dan perilaku partikel di saluran udara tanpa adanya pencampuran antara pernapasan dan detak jantung.Oleh karena itu, pada akhir periode pencitraan, hewan ditidurkan secara manusiawi karena overdosis pentobarbital (Somnopentyl, Pitman-Moore, Washington Crossing, USA; ~65 mg/kg ip).Beberapa hewan ditinggalkan di platform pencitraan, dan setelah penghentian pernapasan dan detak jantung, proses pencitraan diulangi, menambahkan dosis tambahan MP jika tidak ada MP yang terlihat di permukaan saluran napas.
Gambar yang dihasilkan dikoreksi untuk bidang datar dan gelap dan kemudian dirangkai menjadi film (20 frame per detik; 15–25 × kecepatan normal tergantung pada laju pernapasan) menggunakan skrip khusus yang ditulis dalam MATLAB (R2020a, The Mathworks).
Semua studi tentang pengiriman vektor gen LV dilakukan di Pusat Penelitian Hewan Laboratorium Universitas Adelaide dan bertujuan untuk menggunakan hasil percobaan Spring-8 untuk menilai apakah pengiriman LV-MP di hadapan medan magnet dapat meningkatkan transfer gen in vivo .Untuk mengevaluasi efek MF dan medan magnet, dua kelompok hewan diberi perlakuan: satu kelompok disuntik dengan LV MF dengan penempatan magnet, dan kelompok lainnya disuntik dengan kelompok kontrol dengan LV MF tanpa magnet.
Vektor gen LV telah dihasilkan menggunakan metode yang dijelaskan sebelumnya 25, 26 .Vektor LacZ mengekspresikan gen beta-galactosidase lokal nuklir yang digerakkan oleh promotor konstitutif MPSV (LV-LacZ), yang menghasilkan produk reaksi biru dalam sel transduksi, terlihat di bagian depan dan bagian jaringan paru-paru.Titrasi dilakukan dalam kultur sel dengan menghitung jumlah sel LacZ-positif secara manual menggunakan hemositometer untuk menghitung titer dalam TU/ml.Pembawa cryopreserved pada suhu -80°C, dicairkan sebelum digunakan, dan diikat ke CombiMag dengan mencampur 1:1 dan diinkubasi di atas es selama minimal 30 menit sebelum pengiriman.
Tikus Sprague Dawley normal (n = 3/grup, ~2-3 ip terbius dengan campuran 0,4 mg/kg medetomidine (Domitor, Ilium, Australia) dan 60 mg/kg ketamin (Ilium, Australia) pada usia 1 bulan) ip ) injeksi dan kanulasi oral non-bedah dengan kanula intravena 16 Ga.Untuk memastikan bahwa jaringan jalan napas trakea menerima transduksi LV, itu dikondisikan menggunakan protokol perturbasi mekanis yang dijelaskan sebelumnya di mana permukaan jalan napas trakea digosok secara aksial dengan keranjang kawat (N-Circle, ekstraktor batu nitinol tanpa ujung NTSE-022115 ) -UDH , Cook Medical, AS) 30 p28.Kemudian, sekitar 10 menit setelah gangguan di lemari biosafety, pemberian LV-MP trakea dilakukan.
Medan magnet yang digunakan dalam percobaan ini dikonfigurasi serupa dengan studi sinar-X in vivo, dengan magnet yang sama dipegang di atas trakea dengan klem stent distilasi (Gambar 4).Volume 50 µl (2 x 25 µl alikuot) LV-MP dikirim ke trakea (n = 3 hewan) menggunakan pipet berujung gel seperti yang dijelaskan sebelumnya.Kelompok kontrol (n = 3 hewan) menerima LV-MP yang sama tanpa menggunakan magnet.Setelah infus selesai, kanula dikeluarkan dari tabung endotrakeal dan hewan diekstubasi.Magnet tetap di tempatnya selama 10 menit sebelum dilepas.Tikus diberi dosis subkutan dengan meloxicam (1 ml / kg) (Ilium, Australia) diikuti dengan penghentian anestesi dengan injeksi intraperitoneal 1 mg / kg atipamazole hidroklorida (Antisedan, Zoetis, Australia).Tikus tetap hangat dan diamati sampai sembuh total dari anestesi.
Perangkat pengiriman LV-MP dalam lemari keamanan biologis.Anda dapat melihat bahwa selongsong kunci Luer abu-abu muda dari tabung ET menonjol dari mulut, dan ujung pipet gel yang ditunjukkan pada gambar dimasukkan melalui tabung ET ke kedalaman yang diinginkan ke dalam trakea.
Satu minggu setelah prosedur pemberian LV-MP, hewan dikorbankan secara manusiawi dengan menghirup 100% CO2 dan ekspresi LacZ dinilai menggunakan pengobatan X-gal standar kami.Tiga cincin kartilago paling kaudal dihilangkan untuk memastikan bahwa setiap kerusakan mekanis atau retensi cairan karena penempatan tabung endotrakeal tidak akan dimasukkan dalam analisis.Setiap trakea dipotong memanjang untuk mendapatkan dua bagian untuk dianalisis dan ditempatkan dalam cangkir yang berisi karet silikon (Sylgard, Dow Inc) menggunakan jarum Minutien (Fine Science Tools) untuk memvisualisasikan permukaan luminal.Distribusi dan karakter sel yang ditransduksi dikonfirmasi oleh fotografi frontal menggunakan mikroskop Nikon (SMZ1500) dengan kamera DigiLite dan perangkat lunak TCapture (Tucsen Photonics, China).Gambar diperoleh dengan perbesaran 20x (termasuk pengaturan maksimum untuk lebar penuh trakea), dengan seluruh panjang trakea ditampilkan selangkah demi selangkah, memberikan tumpang tindih yang cukup di antara setiap gambar untuk memungkinkan gambar “dijahit”.Gambar dari masing-masing trakea kemudian digabungkan menjadi satu gambar komposit menggunakan Composite Image Editor versi 2.0.3 (Microsoft Research) menggunakan algoritma gerakan planar. Area ekspresi LacZ dalam gambar komposit trakea dari masing-masing hewan dikuantifikasi menggunakan skrip MATLAB otomatis (R2020a, MathWorks) seperti yang dijelaskan sebelumnya28, menggunakan pengaturan 0,35 <Hue <0,58, Saturasi> 0,15, dan Nilai <0,7. Area ekspresi LacZ dalam gambar komposit trakea dari masing-masing hewan dikuantifikasi menggunakan skrip MATLAB otomatis (R2020a, MathWorks) seperti yang dijelaskan sebelumnya28, menggunakan pengaturan 0,35 < Hue < 0,58, Saturation > 0,15, dan Value < 0,7. Площадь экспрессии LacZ в составных изображениях трахеи от каждого животного была количественно определена с использованием автоматизированного сценария MATLAB (R2020a, MathWorks), как описано ранее28, с использованием настроек 0,35 <оттенок <0,58, насыщенность> 0,15 и значение <0 ,7. Area ekspresi LacZ dalam gambar komposit trakea dari setiap hewan dikuantifikasi menggunakan skrip MATLAB otomatis (R2020a, MathWorks) seperti yang dijelaskan sebelumnya28 menggunakan pengaturan 0,350,15 dan nilai <0,7.如前所述，使用自动MATLAB 脚本（R2020a，MathWorks）对来自每只动物的气管复合图像中的LacZ 表达区域进行量化，使用0.35 < 色调< 0.58、饱和度> 0.15 和值< 0.7 的设置。如 前所 述 ， 自动 自动 Matlab 脚本 （（r2020a ， Mathworks） 来自 每 只 的 气管 复合 图像 的 的 的 的 表达 量化 ， 使用 使用 使用 0.35 <色调 <0.58 、> 0.15 和值 <0.7 的。。。。。 .................... PANGGUL Области экспрессии LacZ на составных изображениях трахеи каждого животного количественно определяли с использованием автоматизированного сценария MATLAB (R2020a, MathWorks), как описано ранее, с использованием настроек 0,35 <оттенок <0,58, насыщенность> 0,15 и значение <0,7 . Area ekspresi LacZ pada gambar komposit trakea masing-masing hewan dikuantifikasi menggunakan skrip MATLAB otomatis (R2020a, MathWorks) seperti yang dijelaskan sebelumnya menggunakan pengaturan 0,35 < hue < 0,58, saturasi > 0,15 dan nilai < 0,7 .Dengan melacak kontur jaringan di GIMP v2.10.24, topeng dibuat secara manual untuk setiap gambar komposit untuk mengidentifikasi area jaringan dan mencegah deteksi palsu di luar jaringan trakea.Area yang diwarnai dari semua gambar komposit dari masing-masing hewan dijumlahkan untuk memberikan total area yang diwarnai untuk hewan tersebut.Area yang dicat kemudian dibagi dengan total area topeng untuk mendapatkan area yang dinormalisasi.
Setiap trakea tertanam dalam parafin dan dipotong setebal 5 µm.Bagian diimbangi dengan warna merah cepat netral selama 5 menit dan gambar diperoleh menggunakan mikroskop Nikon Eclipse E400, kamera DS-Fi3 dan perangkat lunak penangkap elemen NIS (versi 5.20.00).
Semua analisis statistik dilakukan di GraphPad Prism v9 (GraphPad Software, Inc.).Signifikansi statistik ditetapkan pada p ≤ 0,05.Normalitas diuji menggunakan uji Shapiro-Wilk dan perbedaan pewarnaan LacZ dinilai menggunakan uji t tidak berpasangan.
Enam MP yang dijelaskan pada Tabel 1 diperiksa oleh PCXI, dan visibilitas dijelaskan pada Tabel 2. Dua MP polistiren (MP1 dan MP2; masing-masing 18 µm dan 0,25 µm) tidak terlihat oleh PCXI, tetapi sampel yang tersisa dapat diidentifikasi. (contoh ditunjukkan pada Gambar 5).MP3 dan MP4 terlihat lemah (10-15% Fe3O4; 0,25 µm dan 0,9 µm, masing-masing).Meskipun MP5 (98% Fe3O4; 0,25 µm) mengandung beberapa partikel terkecil yang diuji, itu yang paling menonjol.Produk CombiMag MP6 sulit dibedakan.Dalam semua kasus, kemampuan kami untuk mendeteksi MF sangat meningkat dengan menggerakkan magnet bolak-balik sejajar dengan kapiler.Saat magnet menjauh dari kapiler, partikel ditarik keluar dalam rantai panjang, tetapi saat magnet mendekat dan kekuatan medan magnet meningkat, rantai partikel memendek saat partikel bermigrasi ke permukaan atas kapiler (lihat Video Tambahan S1 : MP4), meningkatkan densitas partikel di permukaan.Sebaliknya, ketika magnet dilepas dari kapiler, kekuatan medan berkurang dan MP diatur ulang menjadi rantai panjang yang memanjang dari permukaan atas kapiler (lihat Video Tambahan S2: MP4).Setelah magnet berhenti bergerak, partikel terus bergerak selama beberapa waktu setelah mencapai posisi kesetimbangan.Saat MP bergerak menuju dan menjauh dari permukaan atas kapiler, partikel magnetik cenderung menarik kotoran melalui cairan.
Visibilitas MP di bawah PCXI sangat bervariasi antar sampel.(a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 dan (d) MP6.Semua gambar yang ditampilkan di sini diambil dengan magnet yang diposisikan kira-kira 10 mm tepat di atas kapiler.Lingkaran besar yang terlihat adalah gelembung udara yang terperangkap di kapiler, dengan jelas menunjukkan fitur tepi hitam dan putih dari gambar fase kontras.Kotak merah menunjukkan perbesaran yang meningkatkan kontras.Perhatikan bahwa diameter sirkuit magnet di semua gambar tidak berskala dan kira-kira 100 kali lebih besar dari yang ditunjukkan.
Saat magnet bergerak ke kiri dan ke kanan di sepanjang bagian atas kapiler, sudut string MP berubah sejajar dengan magnet (lihat Gambar 6), sehingga menggambarkan garis medan magnet.Untuk MP3-5, setelah akord mencapai sudut ambang batas, partikel terseret di sepanjang permukaan atas kapiler.Hal ini sering mengakibatkan pengelompokan anggota parlemen ke dalam kelompok yang lebih besar di dekat tempat medan magnet terkuat (lihat Video Tambahan S3: MP5).Ini juga sangat jelas ketika pencitraan mendekati ujung kapiler, yang menyebabkan MP berkumpul dan terkonsentrasi pada antarmuka cair-udara.Partikel-partikel di MP6, yang lebih sulit dibedakan daripada di MP3-5, tidak terseret saat magnet bergerak di sepanjang kapiler, tetapi string MP terdisosiasi, meninggalkan partikel dalam tampilan (lihat Video Tambahan S4: MP6).Dalam beberapa kasus, ketika medan magnet yang diterapkan dikurangi dengan menggerakkan magnet jauh dari lokasi pencitraan, anggota parlemen yang tersisa perlahan-lahan turun ke permukaan bawah tabung dengan gravitasi, tetap berada di tali (lihat Video Tambahan S5: MP3) .
Sudut senar MP berubah saat magnet bergerak ke kanan di atas kapiler.(a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 dan (d) MP6.Kotak merah menunjukkan perbesaran yang meningkatkan kontras.Harap perhatikan bahwa video tambahan adalah untuk tujuan informasi karena mengungkapkan struktur partikel penting dan informasi dinamis yang tidak dapat divisualisasikan dalam gambar statis ini.
Pengujian kami telah menunjukkan bahwa menggerakkan magnet bolak-balik secara perlahan di sepanjang trakea memfasilitasi visualisasi MF dalam konteks gerakan kompleks in vivo.Tidak ada tes in vivo yang dilakukan karena manik-manik polistiren (MP1 dan MP2) tidak terlihat di kapiler.Masing-masing dari empat MF yang tersisa diuji in vivo dengan sumbu panjang magnet yang diposisikan di atas trakea pada sudut sekitar 30 ° ke vertikal (lihat Gambar 2b dan 3a), karena ini menghasilkan rantai MF yang lebih panjang dan lebih efektif. daripada magnet..konfigurasi dihentikan.MP3, MP4 dan MP6 belum ditemukan di trakea hewan hidup mana pun.Saat memvisualisasikan saluran pernapasan tikus setelah membunuh hewan secara manusiawi, partikel tetap tidak terlihat bahkan ketika volume tambahan ditambahkan menggunakan pompa jarum suntik.MP5 memiliki kandungan oksida besi tertinggi dan merupakan satu-satunya partikel yang terlihat, sehingga digunakan untuk mengevaluasi dan mengkarakterisasi perilaku MP in vivo.
Penempatan magnet di atas trakea selama penyisipan MF menghasilkan banyak, tetapi tidak semua, MF terkonsentrasi di bidang pandang.Masuknya partikel ke trakea paling baik diamati pada hewan yang di-eutanasia secara manusiawi.Gambar 7 dan Video Tambahan S6: MP5 menunjukkan penangkapan magnetik yang cepat dan penyelarasan partikel pada permukaan trakea ventral, menunjukkan bahwa MP dapat ditargetkan ke area trakea yang diinginkan.Ketika mencari lebih jauh di sepanjang trakea setelah pengiriman MF, beberapa MF ditemukan lebih dekat ke karina, yang menunjukkan kekuatan medan magnet yang tidak mencukupi untuk mengumpulkan dan menahan semua MF, karena mereka dikirim melalui wilayah dengan kekuatan medan magnet maksimum selama pemberian cairan.proses.Namun, konsentrasi MP pascakelahiran lebih tinggi di sekitar area gambar, menunjukkan bahwa banyak MP tetap berada di daerah jalan napas di mana kekuatan medan magnet yang diterapkan paling tinggi.
Gambar (a) sebelum dan (b) setelah pengiriman MP5 ke dalam trakea tikus yang baru saja di-eutanasia dengan magnet ditempatkan tepat di atas area pencitraan.Area yang digambarkan terletak di antara dua cincin tulang rawan.Ada beberapa cairan di saluran udara sebelum MP dikirim.Kotak merah menunjukkan perbesaran yang meningkatkan kontras.Gambar-gambar ini diambil dari video yang ditampilkan di S6: MP5 Supplementary Video.
Memindahkan magnet di sepanjang trakea in vivo menghasilkan perubahan sudut rantai MP pada permukaan jalan napas, serupa dengan yang diamati pada kapiler (lihat Gambar 8 dan Video Tambahan S7: MP5).Namun, dalam penelitian kami, anggota parlemen tidak dapat terseret di sepanjang permukaan saluran pernapasan hidup, seperti yang dapat dilakukan oleh kapiler.Dalam beberapa kasus, rantai MP memanjang saat magnet bergerak ke kiri dan ke kanan.Menariknya, kami juga menemukan bahwa rantai partikel mengubah kedalaman lapisan permukaan cairan saat magnet digerakkan secara longitudinal di sepanjang trakea, dan mengembang saat magnet digerakkan tepat di atas kepala dan rantai partikel diputar ke posisi vertikal (lihat Video Tambahan S7).: MP5 pada 0:09, kanan bawah).Pola pergerakan yang khas berubah ketika magnet digerakkan secara lateral melintasi bagian atas trakea (yaitu, ke kiri atau kanan hewan, bukan sepanjang trakea).Partikel masih terlihat jelas selama pergerakannya, tetapi ketika magnet dikeluarkan dari trakea, ujung rangkaian partikel menjadi terlihat (lihat Video Tambahan S8: MP5, mulai dari 0:08).Ini sesuai dengan perilaku yang diamati dari medan magnet di bawah aksi medan magnet yang diterapkan dalam kapiler kaca.
Contoh gambar menunjukkan MP5 di trakea tikus hidup yang dianestesi.(a) Magnet digunakan untuk memperoleh gambar di atas dan kiri trakea, kemudian (b) setelah menggerakkan magnet ke kanan.Kotak merah menunjukkan perbesaran yang meningkatkan kontras.Gambar-gambar ini berasal dari video yang ditampilkan di Video Tambahan S7: MP5.
Ketika kedua kutub disetel dalam orientasi utara-selatan di atas dan di bawah trakea (yaitu, menarik; Gambar 3b), akord MP tampak lebih panjang dan terletak di dinding lateral trakea daripada di permukaan dorsal trakea. trakea (lihat Lampiran).Video S9:MP5).Namun, konsentrasi partikel yang tinggi pada satu tempat (yaitu, permukaan dorsal trakea) tidak terdeteksi setelah pemberian cairan menggunakan perangkat magnet ganda, yang biasanya terjadi dengan perangkat magnet tunggal.Kemudian, ketika satu magnet dikonfigurasikan untuk menolak kutub yang berlawanan (Gambar 3c), jumlah partikel yang terlihat di bidang pandang tidak bertambah setelah dikirim.Menyiapkan kedua konfigurasi magnet itu menantang karena kekuatan medan magnet yang tinggi yang masing-masing menarik atau mendorong magnet.Pengaturan kemudian diubah menjadi magnet tunggal yang sejajar dengan saluran udara tetapi melewati saluran udara pada sudut 90 derajat sehingga garis gaya melintasi dinding trakea secara ortogonal (Gambar 3d), sebuah orientasi yang dimaksudkan untuk menentukan kemungkinan agregasi partikel pada dinding samping.dilihat.Namun, dalam konfigurasi ini, tidak ada gerakan akumulasi MF atau gerakan magnet yang dapat diidentifikasi.Berdasarkan semua hasil ini, konfigurasi dengan magnet tunggal dan orientasi 30 derajat dipilih untuk studi in vivo pembawa gen (Gbr. 3a).
Ketika hewan itu dicitrakan beberapa kali segera setelah dikorbankan secara manusiawi, tidak adanya gerakan jaringan yang mengganggu berarti bahwa garis partikel yang lebih halus dan lebih pendek dapat dilihat di bidang intercartilaginous yang jelas, 'bergoyang' sesuai dengan gerakan translasi magnet.melihat dengan jelas keberadaan dan pergerakan partikel MP6.
Titer LV-LacZ adalah 1,8 x 108 IU/mL, dan setelah pencampuran 1:1 dengan CombiMag MP (MP6), hewan diinjeksi dengan 50 µl dosis trakea 9 x 107 IU/ml kendaraan LV (yaitu 4,5 x 106 TU/tikus).).).Dalam studi ini, alih-alih menggerakkan magnet selama persalinan, kami memasang magnet di satu posisi untuk menentukan apakah transduksi LV dapat (a) ditingkatkan dibandingkan dengan pengiriman vektor tanpa adanya medan magnet, dan (b) jika jalan napas bisa fokus.Sel-sel yang ditransduksi di area target magnetik saluran pernapasan bagian atas.
Kehadiran magnet dan penggunaan CombiMag dalam kombinasi dengan vektor LV tampaknya tidak berdampak buruk bagi kesehatan hewan, seperti halnya protokol pengiriman vektor LV standar kami.Gambar frontal dari daerah trakea yang mengalami gangguan mekanis (Gambar Tambahan 1) menunjukkan bahwa kelompok yang diobati dengan LV-MP memiliki tingkat transduksi yang jauh lebih tinggi dengan adanya magnet (Gambar 9a).Hanya sedikit pewarnaan LacZ biru yang ada pada kelompok kontrol (Gambar 9b).Kuantifikasi daerah normalisasi bernoda X-Gal menunjukkan bahwa pemberian LV-MP dengan adanya medan magnet menghasilkan peningkatan sekitar 6 kali lipat (Gbr. 9c).
Contoh gambar komposit yang menunjukkan transduksi trakea dengan LV-MP (a) dengan adanya medan magnet dan (b) dengan tidak adanya magnet.(c) Peningkatan yang signifikan secara statistik pada area normalisasi transduksi LacZ di trakea dengan penggunaan magnet (*p = 0,029, uji-t, n = 3 per kelompok, rata-rata ± standar kesalahan rata-rata).
Bagian bernoda merah cepat netral (contoh ditunjukkan pada Gambar Tambahan. 2) menunjukkan bahwa sel bernoda LacZ hadir dalam sampel yang sama dan di lokasi yang sama seperti yang dilaporkan sebelumnya.
Tantangan utama dalam terapi gen jalan napas tetap pada lokalisasi yang tepat dari partikel pembawa di bidang yang diminati dan pencapaian efisiensi transduksi tingkat tinggi di paru-paru bergerak dengan adanya aliran udara dan pembersihan lendir aktif.Untuk pembawa LV yang dimaksudkan untuk pengobatan penyakit pernapasan pada fibrosis kistik, meningkatkan waktu tinggal partikel pembawa dalam saluran udara konduktif sampai sekarang merupakan tujuan yang tidak dapat dicapai.Seperti yang ditunjukkan oleh Castellani et al., penggunaan medan magnet untuk meningkatkan transduksi memiliki keunggulan dibandingkan metode pengiriman gen lainnya seperti elektroporasi karena dapat menggabungkan kesederhanaan, ekonomi, pengiriman lokal, peningkatan efisiensi, dan waktu inkubasi yang lebih singkat.dan mungkin dosis kendaraan yang lebih rendah10.Namun, deposisi in vivo dan perilaku partikel magnetik di saluran udara di bawah pengaruh gaya magnet eksternal tidak pernah dijelaskan, dan pada kenyataannya kemampuan metode ini untuk meningkatkan level ekspresi gen di saluran udara hidup yang utuh belum ditunjukkan secara in vivo.
Eksperimen in vitro kami pada sinkrotron PCXI menunjukkan bahwa semua partikel yang kami uji, kecuali polistiren MP, terlihat dalam pengaturan pencitraan yang kami gunakan.Di hadapan medan magnet, medan magnet membentuk string, yang panjangnya terkait dengan jenis partikel dan kekuatan medan magnet (yaitu kedekatan dan pergerakan magnet).Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 10, string yang kita amati terbentuk saat setiap partikel termagnetisasi dan menginduksi medan magnet lokalnya sendiri.Medan terpisah ini menyebabkan partikel serupa lainnya berkumpul dan terhubung dengan gerakan string grup karena gaya lokal dari gaya tarik dan tolakan lokal partikel lain.
Diagram menunjukkan (a,b) rantai partikel yang terbentuk di dalam kapiler berisi cairan dan (c,d) trakea berisi udara.Perhatikan bahwa kapiler dan trakea tidak ditarik ke skala.Panel (a) juga memuat deskripsi MF yang mengandung partikel Fe3O4 yang tersusun dalam rantai.
Ketika magnet bergerak di atas kapiler, sudut string partikel mencapai ambang kritis untuk MP3-5 yang mengandung Fe3O4, setelah itu string partikel tidak lagi berada di posisi semula, tetapi bergerak di sepanjang permukaan ke posisi baru.magnet.Efek ini kemungkinan besar terjadi karena permukaan kapiler kaca cukup halus untuk memungkinkan terjadinya gerakan ini.Menariknya, MP6 (CombiMag) tidak berperilaku seperti ini, mungkin karena partikelnya lebih kecil, memiliki lapisan atau muatan permukaan yang berbeda, atau cairan pembawa yang dipatenkan memengaruhi kemampuannya untuk bergerak.Kontras pada gambar partikel CombiMag juga lebih lemah, menunjukkan bahwa cairan dan partikel mungkin memiliki kerapatan yang sama sehingga tidak dapat dengan mudah bergerak ke arah satu sama lain.Partikel juga dapat tersangkut jika magnet bergerak terlalu cepat, menandakan bahwa kekuatan medan magnet tidak selalu dapat mengatasi gesekan antar partikel dalam fluida, menunjukkan bahwa kekuatan medan magnet dan jarak antara magnet dan area target tidak boleh datang sebagai a kejutan.penting.Hasil ini juga menunjukkan bahwa meskipun magnet dapat menangkap banyak partikel mikro yang mengalir melalui area target, kecil kemungkinan magnet dapat diandalkan untuk menggerakkan partikel CombiMag di sepanjang permukaan trakea.Dengan demikian, kami menyimpulkan bahwa studi LV MF in vivo harus menggunakan medan magnet statis untuk secara fisik menargetkan area tertentu dari pohon saluran napas.
Setelah partikel dikirim ke dalam tubuh, mereka sulit untuk diidentifikasi dalam konteks jaringan tubuh yang bergerak kompleks, tetapi kemampuan pendeteksiannya telah ditingkatkan dengan menggerakkan magnet secara horizontal di atas trakea untuk "menggoyangkan" senar MP.Meskipun pencitraan waktu nyata dimungkinkan, lebih mudah untuk melihat pergerakan partikel setelah hewan tersebut dibunuh secara manusiawi.Konsentrasi MP biasanya paling tinggi di lokasi ini ketika magnet diposisikan di atas area pencitraan, meskipun beberapa partikel biasanya ditemukan lebih jauh di bawah trakea.Tidak seperti penelitian in vitro, partikel tidak dapat ditarik ke bawah trakea dengan pergerakan magnet.Temuan ini konsisten dengan bagaimana lendir yang menutupi permukaan trakea biasanya memproses partikel yang dihirup, menjebaknya di dalam lendir dan kemudian membersihkannya melalui mekanisme pembersihan muco-ciliary.
Kami berhipotesis bahwa menggunakan magnet di atas dan di bawah trakea untuk menarik (Gbr. 3b) dapat menghasilkan medan magnet yang lebih seragam, daripada medan magnet yang sangat terkonsentrasi pada satu titik, yang berpotensi menghasilkan distribusi partikel yang lebih seragam..Namun, studi pendahuluan kami tidak menemukan bukti yang jelas untuk mendukung hipotesis ini.Demikian pula, menyetel sepasang magnet untuk menolak (Gbr. 3c) tidak menghasilkan lebih banyak partikel yang mengendap di area gambar.Kedua temuan ini menunjukkan bahwa pengaturan dual-magnet tidak secara signifikan meningkatkan kontrol lokal penunjuk MP, dan gaya magnet kuat yang dihasilkan sulit untuk disetel, membuat pendekatan ini kurang praktis.Demikian pula, mengarahkan magnet di atas dan melintasi trakea (Gambar 3d) juga tidak meningkatkan jumlah partikel yang tersisa di area yang dicitrakan.Beberapa konfigurasi alternatif ini mungkin tidak berhasil karena menghasilkan pengurangan kekuatan medan magnet di zona pengendapan.Dengan demikian, konfigurasi magnet tunggal pada 30 derajat (Gbr. 3a) dianggap sebagai metode pengujian in vivo yang paling sederhana dan paling efisien.
Studi LV-MP menunjukkan bahwa ketika vektor LV digabungkan dengan CombiMag dan dikirim setelah terganggu secara fisik dengan adanya medan magnet, tingkat transduksi meningkat secara signifikan di trakea dibandingkan dengan kontrol.Berdasarkan studi pencitraan synchrotron dan hasil LacZ, medan magnet ternyata mampu menjaga LV di trakea dan mengurangi jumlah partikel vektor yang segera menembus jauh ke dalam paru-paru.Peningkatan penargetan seperti itu dapat menghasilkan efisiensi yang lebih tinggi sekaligus mengurangi titer yang disampaikan, transduksi yang tidak ditargetkan, efek samping peradangan dan kekebalan, dan biaya transfer gen.Yang penting, menurut produsennya, CombiMag dapat digunakan dalam kombinasi dengan metode transfer gen lainnya, termasuk vektor virus lainnya (seperti AAV) dan asam nukleat.